ОТ-ПЦР на матрице РНК
Проведение ОТ-ПЦР на матрице РНК - это модификация метода ПЦР. ОТ-ПЦР используют для выявления молекул РНК. Метод возник как последовательное проведение двух реакций. В I стадии - обратной транскрипции с помощью одного праймера, комплементарного исследуемой РНК, субстратов реакции ( dNTPs ) и матрицы РНК происходит ферментативный синтез копий ДНК ( кДНК ) с матрицы РНК ( рис. 2.44 ). II стадия - это классическая ПЦР, подробно описанная выше.
I стадию проводят с использованием мезофильной ревертазы (фермент, синтезирующий кДНК на матрице РНК). Существенной проблемой использования РНК в качестве матрицы является наличие сложной вторичной структуры молекул РНК. Некоторые исследователи используют вещества, дестабилизирующие молекулу РНК: метилртуть или диметилсульфоксид (DMSO) . Однако добавление таких веществ может снизить эффективность синтеза и амплификации кДНК. Другой подход - повышение температуры обратной транскрипции более 42*С, следовательно, использование термостабильных ферментов. ОТ-ПЦР можно проводить как в различных пробирках (в две стадии), так и в одной пробирке (совмещенную ОТ-ПЦР) без существенной потери чувствительности.
ПЦР и ОТ-ПЦР проводят в приборах, называемых амплификатерами или термоциклерами. В настоящее время существует множество моделей. На рис. 2.45 изображены две модели: четырехблоковый "Терцик" отечественного производства и Hibaid - английский амплификатор, состоящий из двух блоков.
Смотрите также:
