Постановка РГА и РТГА микрометодом с антигенами арбовирусов
Постановку РГА и РТГА микрометодом с антигенами арбовирусов осуществляют в полистироловых 96-луночных панелях. Разведения антигенов готовят на альбумино-боратном буфере, разведения сывороток - на боратном буфере рН 9,0. РГА и РТГА ставят в общем объеме 200 мкл. Если антиген заведомо высокого титра, то его начинают титровать с разведения 1:100. К каждому разведению антигена в объеме 100 мкл. добавляют по 100 мкл свежеприготовленной 0,4% взвеси гусиных эритроцитов в фосфатном буфере оптимального рН и двух смежных. Например, если оптимальным является рН 6,4, то РГА ставят с рН 6,2, 6,4 и 6,6. Отдельно ставят контроль эритроцитов без антигена на отсутствие спонтанной агглютинации. Пластины осторожно встряхивают для перемешивания ингредиентов и оставляют до полного осаждения эритроцитов в контрольных лунках. При отсутствии специфической реакции эритроциты, оседая, имеют вид компактного осадка. Полная гемагглютинация имеет вид однородной пленки эритроцитов, покрывающей дно лунки. При неполной гемагглютинации пленка сочетается с плотным осадком эритроцитов.
Титром антигена считают наивысшее его разведение, при котором обнаруживается интенсивная гемагглютинация ("+++" или "++++"). Рабочей дозой антигена является 8 агглютинирующих единиц (АЕ) в 1 капле. Антиген титруют в РГА, как указано выше. Исходя из титра антигена, готовят разведение антигена, содержащее 16 АЕ. При соединении с сывороткой в реакции участвуют 8 АЕ антигена. После того как будет приготовлено рабочее разведение антигена ( табл. 2.18 ), проводят его контрольное титрование, чтобы убедиться в правильности выбранной дозы. Для этого из рабочего разведения антигена, содержащего 16 АЕ, делают 5-6 двукратных разведений в объеме 50 мкл и добавляют по 50 мкл эритроцитов. Если доза выбрана правильно, то гемагглютинация должна быть в 4 лунках.
В РТГА двукратные разведения сыворотки взаимодействуют с постоянной дозой антигена - разведением, содержащим 8 АЕ антигена. Реакцию ставят в объеме 200 мкл: по 50 мкл антигена и сыворотки и 100 мкл 0,4% взвеси эритроцитов в фосфатном буфере оптимального для данного антигена рН. Реакция протекает в два этапа. Первый этап - соединение сывороток и антигенов: контакт их при температуре 4*С в течение 18-20 ч. Второй этап - добавление эритроцитов, экспозиция 20-40 мин и учет результатов.
При диагностических исследованиях сыворотку крови, взятую в остром и реконвалесцентном периодах, титруют только в одном и том же опыте одновременно, чтобы получить сопоставимые результаты.
Если рабочее разведение антигена содержит более 16 АЕ, следует его развести, если менее 16 АЕ, то нужно добавить соответствующее количество антигена и снова протитровать, чтобы проверить правильность рабочей дозы. Рабочую дозу антигена контролируют повторно при учете результатов РТГА, чтобы узнать истинное количество доз антигена в реакции.
К 50 мкл каждого разведения сыворотки добавляют по 50 мкл антигена в рабочей дозе. Пластины осторожно встряхивают, закрывают крышками и помешают в холодильник при температуре 4-6*С на 18-20 ч. На следующий день в каждую лунку добавляют по 100 мкл 0,4% взвеси эритроцитов в фосфатном буфере оптимального рН. Пластины встряхивают, оставляют при комнатной температуре и определяют РТГА через 30-40 мин. Чтобы исключить неспецифические реакции ставят следующие контроли: контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию (100 мкл 0,4% взвеси эритроцитов и 100 мкл АББ); контроль на полноту удаления неспецифических ге-магглютининов из сыворотки (50 мкл обработанной сыворотки, 50 мкл АББ и 100 мкл эритроцитов); контроль рабочей дозы антигена; контроль специфичности антигена с гомологичной иммунной сывороткой.
Титром сыворотки считают наивысшее разведение, которое вызывает полную задержку гемагглютинации с 8 АЕ антигена. Сыворотки считают положительными, если они подавляют гемагтлютинацию в разведении 1:10 и более. Одной из наиболее частых ошибок при оценке результатов РТГА является учет положительных результатов, связанных с неполным удалением ингибиторов, поэтому все сыворотки, положительные в предварительном опыте РТГА, при повторном их титровании должны пройти контроль на ингибиторы. Для этого их прогревают (в разведении 1:10) в течение 1 мин в кипящей бане и в одном или нескольких разведениях испытывают в РТГА против 8 АЕ антигена. Прогревание приводит к разрушению антител, а ингибиторы, как правило, остаются и подавляют гемагглютинацию. Косвенным показателем наличия ингибиторов является взаимодействие сыворотки с несколькими антигенами арбовирусов разных антигенных групп.
Смотрите также:
