Принципы просвечивающей электронной микроскопии: общие сведения
С момента создания электронного микроскопа (1931 г.) этот прибор стал незаменимым инструментом в руках ученых изучающих тонкую структуру биологических объектов.
Напомним, что излучение определенной длины волны лямбда может быть использовано для исследования только таких структур, минимальные размеры которых соизмеримы с длиной волны самого излучения. Этот фундаментальный принцип ограничивает возможности любого микроскопа. Предел разрешения (т.е. минимального расстояния, при котором два объекта могут наблюдаться в отдельности) светового микроскопа определяется длиной световой волны и равно 0,2 мкм (200 нм). Изображение объектов с линейными размерами менее 0,5 мкм будут искажены в световом микроскопе вследствие эффекта дифракции . В случае ЭМ предел разрешения значительно ниже, т.к. волна электрона в ЭМ с напряжением 100 кВ равна примерно 0,004 нм и, согласно теории, разрешение такого ЭМ составляет 0,002 нм. Однако из-за разного рода аберраций в реальности разрешение современного ЭМ в лучшем случае 1 Е и может быть достигнуто для образцов неорганического происхождения. Трудности приготовления биологических образцов, повреждение их излучением существенно снижают разрешение при работе с ними. При этом оно составляет величину около 20 Е. В то же время применение криометодов при подготовке биологических образцов повышает разрешение до 5-15 Е.
Схематично конструкция ПЭ-микроскопа напоминает конструкцию светового. Источником излучения в ПЭМ является нить катода, испускающая электроны при ее нагреве, к которой приложено ускоряющее напряжение порядка десятков киловольт.
Таким образом, формируется электронный пучок. Катод расположен в цилиндрической колонне высотой около 2м. А поскольку при столкновении с молекулами воздуха электроны рассеиваются, в колонне создают высокий вакуум. Вдоль колонны располагаются кольцевые электромагниты (магнитные линзы), фокусирующие луч подобно стеклянным линзам, фокусирующим луч света. Электроны при прохождении через образец формируют его изображение на флюоресцирующем экране, которое регистрируется на фотопленку или на цифровой носитель.
Но даже наиболее изощренные методы ЭМ не дают возможности полностью описать молекулярную структуру, т.к. атомы в молекулах разделены расстоянием 1-2 Е. Для молекулярной структуры макромолекул на атомном уровне используют метод рентгеноструктурного анализа .
Методы, основанные на криофиксации и использовании низких температур при подготовке биологического материала различного происхождения для последующего его изучения в ПЭ-микроскопе, нашли широкое применение в научных исследованиях. Основным преимуществом использования низких температур в структурных исследованиях является возможность исключения или сведения к минимуму артефактов химической фиксации и сохранение таким образом пространственной структуры изучаемого объекта близким к нативному, а также его антигенных свойств. Эти методы позволяют определять ультраструктуру мембран клетки, ее органелл, вирусных частиц и их компонентов. К ним относятся: метод замораживания-высушивания, криоскалывания, замораживания-замещения, криоультратомия, криоэлектронный, иммуноцитохимические методы с использованием сред, полимеризующихся при низких температурах.
Смотрите также:
