Проведение ПЦР на матрице ДНК
Метод ПЦР основан на 3-х этапном циклическом процессе, в результате которого многократно увеличивается количество специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл ПЦР состоит из трех последовательных стадий: денатурация (94-95*С); отжиг (гибридизация) праймеров (50-60*С); полимеризация или элонгация (удлинение) цепи ДНК (72-*С).
Во время денатурации ( рис. 2.43 , А) под действием высокой температуры (94-95*С) происходит расплавление двухцепочечной ДНК - цепи ДНК разделяются и ДНК переходит в однонитевую форму. Таким образом освобождается место для "посадки" или гибридизации праймеров .
При понижении температуры до температуры отжига (50-60*С) специфические одноцепочечные участки ДНК (праймеры) гибридизуются с комплементарным участком матрицы (исходной, расплавленной ДНК), т.е. образуют двунитевую ДНК ( рис. 2.43 , Б). Праймеры синтезируются химическим путем и ограничивают исследуемый специфический участок ДНК. В молекулярной биологии гибридизацию праймеров на специфическом участке ДНК называют отжигом. Каждый из праймеров гибридизуется на одной из двух цепей ДНК таким образом, что З'-гидроксильные концы праймеров, которые способны удлиняться, направлены навстречу друг другу. После гибридизации праймеры строго ограничивают специфический участок ДНК.
Праймеры подбираются с помощью компьютерных программ. Основным критерием подбора праймеров является комплементарность матрице, особенно важна полная комплементарность 2-3 н.о. на З'-конце праймеров. Важным фактором, влияющим на эффективность и специфичность амплификации, является подбор оптимальной температуры отжига праймеров на матрице. Данная температура зависит от длины праймеров и их G-C-состава. Для олигонуклеотидов длиной 14-70 н.о. используется эмпирическая формула, позволяющая рассчитать оптимальную температуру отжига праймеров:
Т (*С) = 4 (G+C) + 2 (A+Т) - 3,
где A ( аденин ), Т ( тимин ), G ( гуанин ), С ( цитозин ) - число соответствующих нуклеотидов в одном праймере.
При повышении температуры до 72*С создаются оптимальные условия для эффективной работы термостабильной ДНК-полимеразы. В процессе элонгации происходит реакция, осуществляемая термостабильной ДНК- полимеразой. ДНК-полимераза связывается с участком ДНК, в котором одна из цепей непрерывна (матрица), а другая заканчивается З'-концом и содержит 3-гидроксил, необходимый для продолжения цепи (праймер). После этого фермент в комплексе с матрицей и праймером связывает соответствующий следующему нуклеотидному звену матрицы субстрат и катализирует реакцию его присоединения ( рис. 2.43 , В).
Химическая реакция, обеспечивающая данный процесс, заключается в конденсации растущей цепи ДНК с очередным субстратом. Субстратом полимеразной реакции являются 4 дезоксинуклеотидтрифосфата (dNTP) :
(pdN)n + PзdN = (pdN)n+1 + PPi,
где (pdN)n - растущая цепь ДНК;
PзdN - dNTP (дезоксинуклеотидтрифосфат);
(pdN)n+1 - цепь ДНК, удлиненная на один нуклеотид;
PPi - пирофосфат .
Доказательство этой химической схемы, а также выделение первой ДНК-полимеразы осуществили А.Корнберг и соавт.
Следующий цикл реакции начинается денатурацией полученной ДНК. В этом случае получается в 2 раза больше молекул, на которых будут гибридизоваться праймеры. Серия повторяющихся циклов позволяет получить экспоненциальное накопление фрагмента ДНК. В идеальном случае наработка специфического фрагмента подчиняется закону (2 во 2-ой степени - 2n) раз, где n - число циклов, а 2n - продукт неопределенной длины, полученный в каждом цикле с исходной матрицы ДНК. После проведения 25-30 циклов происходит увеличение фрагмента в (10 в 6-ой степени - 10 в 8-ой степени) раз. Длина фрагмента, нарабатывающегося в ПЦР, равна сумме длин двух праймеров плюс расстояние на ДНК-матрице между праймерами.
Смотрите также:
