РГА и РТГА: выявление гемагглютининов вирусов гриппа
Особенности постановки РГА и РТГА для выявления гемагглютининов вирусов гриппа.
Постановка РГА предусматривает проведение 2- или 10-кратных разведений вирус-содержащего материала в 96-луночных планшетах с V- или U-образным дном в объеме 50 мкл с последующим добавлением равного объема взвеси эритроцитов. Наибольшее разведение антигена, при котором наблюдается полная агглютинация эритроцитов, принимают за его титр вируса.
Различия между вирусами гриппа A и вирусами гриппа В , определение субтипа вируса гриппа A , парагриппозных вирусов являются первым шагом в характеристике новых агглютинирующих изолятов. Кроме того, определение уровней специфических антител приобретает важное значение, особенно при ретроспективной диагностике гриппа у людей. Для этих исследований традиционно применяют РТГА. В зависимости от поставленной цели в реакции используют диагностические сыворотки (полученные при иммунизации крыс, хорьков, овец или птиц) или диагностические антигены к циркулирующим штаммам.
Постановка РТГА включает в себя следующие основные этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов; определение титра антигена и выбор его рабочей дозы; обработка сывороток (с целью удаления) неспецифических ингибиторов.
Для постановки реакции используют эритроциты того животного, с которыми исследуемый вирус дает наиболее постоянные результаты: грипп A и В - 0,75% эритроциты человека 0(1) группы крови (для вирусов гриппа, выделенных на культуре клеток MDCK); 0,6% эритроциты кур (для вирусов гриппа, выделенных на куриных эмбрионах) и 0,5% эритроциты морской свинки (для вирусов парагриппа).
Одним из наиболее существенных факторов неспецифического противогриппозного иммунитета являются ингибиторы неспецифического противогриппозного иммунитета - вещества, содержащиеся в сыворотках человека и животных. По своим биологическим свойствам они неоднородны. Выделяют альфа-, бета- и гамма-типы ингибиторов. Причем альфа и бета-типы термолабильны и неактивны после прогревания при температуре 56*С в течение 30 мин. В то же время гамма-ингибиторы термостабильны и для их разрушения необходима специальная обработка. Среди реактивов, используемых для обработки сывороток можно выделить следующие: фильтрат нехолерного вибриона (содержит нейраминидазу); периодат калия (0,05 М KJ04) или каолин (25% взвесь в физиологическом растворе).
Постановку реакции проводят в 96-луночных планшетах с V- или U- образным дном. В планшет вносят по 25 мкл физиологического раствора за исключением 1-й лунки, в которую вносят 50 мкл сыворотки, обработанной от ингибиторов. Готовят двукратные разведения сыворотки, перенося по 25 мкл последовательно из 1-й лунки во 2-ю и т.д. Затем в каждую лунку добавляют по 25 мкл антигена в рабочей дозе 8 АЕ, встряхивают и оставляют на контакт в течение 30 мин при комнатной температуре (вирусы гриппа) или при 4*С (вирусы парагриппа). После контакта во все лунки добавляют по 50 мкл взвеси эритроцитов и оставляют на контакт в течение 30-60 мин.
Для определения типа или подтипа вируса используют диагностическую референс-сыворотку. Подавление гемагглютинации указывает на соответствие вида вируса и взятой сыворотки.
При наличии гомологичных антител в исследуемой сыворотке в РТГА с референс-антигеном наступает подавление гемагглютинации. Титром сыворотки является ее наибольшее разведение, вызывающее полное подавление гемагглютинации. Пробы сывороток, взятые в острый период болезни и через 2-3 нед после выздоровления, проверяются одновременно. Диагностическое значение имеет нарастание титра антител в 4 раза и более.
Смотрите также:
