РГА и РТГА: общие сведения
Ингредиенты для постановки РГА и РТГА с арбовирусами: антигены, сыворотки, эритроциты гусей, боратный буферный раствор (рН 9,0), фосфатные буферные растворы (рН 6,0 и 7,0), альбумино-боратный буферный раствор (рН 9,0), 25% взвесь каолина на боратном буферном растворе (рН 9,0), раствор Альзовера, декстрозо-желатин-вероналовый буферный раствор ( табл. 2.17 ).
Антигены. Для РГА и РТГА используют антигены, приготовленные из вируссодержащих органов или сыворотки крови зараженных мышей, из инфицированных клеточных культур. Для приготовления антигенов вируссодержащие субстраты освобождают от ингибиторов гемагглютининов. Методы приготовления гемагглютинирующих антигенов подробно изложены в [ Шубладзе, 1954 ].
Подготовка сывороток крови для РТГА. Для удаления ингибиторов гемагглютинации и нормальных агглютининов гусиных эритроцитов сыворотку крови обрабатывают одним из двух методов: адсорбция каолином и гусиными эритроцитами или экстракция ацетоном. Оба способа дают практически одинаковые результаты при обработке сывороток людей, мышей, морских свинок, кроликов. При работе с сыворотками птиц следует применять обработку ацетоном. Сыворотки, предназначенные для постановки РТГА на антитела к арбовирусам, нельзя прогревать! Обработанные сыворотки пригодны для использования в течение 7-10 сут, если они хранятся при температуре 2-4*С.
Адсорбция каолином. Цельную сыворотку разводят 1:5 боратным буфером, рН 9,0 и добавляют равное количество 25% взвеси каолина. Смесь встряхивают в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем центрифугируют 10-15 мин при 2500-3000 об./мин. Надосадочная жидкость представляет собой обработанную сыворотку в разведении 1:10.
Экстракция ацетоном. Сыворотку разводят 1:5 охлажденным физиологическим раствором и добавляют 12 объемов охлажденного ацетона на 1 объем разведенной сыворотки. Образовавшийся преципитат осаждают центрифугированием при 2500-3000 об./мин в течение 5 мин, затем ацетон удаляют. Обработку повторяют еще дважды, используя каждый раз свежую порцию ацетона в первоначальном количестве. Осадок высушивают в слабом вакууме до образования сухого порошка, который разводят боратным буфером, чтобы получить конечное разведение сыворотки 1:10.
Удаление нормальных агглютининов гусиных эритроцитов. На каждые 5 мл разведенной 1:10 сыворотки после ее обработки коалином или ацетоном добавляют 100 мкл осадка гусиных эритроцитов. Адсорбцию проводят в ледяной бане в течение 20 мин, периодически встряхивая пробирки. Эритроциты удаляют центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об./мин.
Получение и подготовка эритроцитов гусей. Для РГА и РТГА используют эритроциты гусей-самцов. Кровь берут из подключичной вены в антикоагулирующий раствор Альзовера. Затем эритроциты трижды отмывают декстрано-желатино-вероналовым буферным раствором в 3 раза большем объеме, чем исходный объем крови, центрифугируя после каждой отмывки по 10-15 мин со скоростью 1500-2000 об./мин. Из осадка эритроцитов на том же буфере готовят 10% взвесь и хранят ее в широкодонных колбах под рыхлой ватной пробкой. Из этой основной суспензии готовят рабочее разведение эритроцитов. Для постановки реакции микрометодом используют 0,4% взвесь эритроцитов в фосфатном буфере с соответствующим значением (на 10 мл буфера - 0,4 мл 10% суспензии эритроцитов).
Боратный буферный раствор. Для приготовления 1 л боратного буферного раствора рН 9,0 берут NaCl (8,8 г), НзВОз (3,15 г), NaOH (0,96 г). Навеску борной кислоты растворяют в 200 мл горячей дистиллированной воды, добавляют поваренную соль и едкий натрий. Раствор охлаждают до температуры 20*С и доводят объем до 1 л; рН раствора после измерения (в случае отклонения) должен быть откорректирован до точного значения 9,0.
Фосфатные буферные растворы с рН 6,0 и 7,0 используют для приготовления взвеси эритроцитов. Показатели рН 6,0 и 7,0 в данном случае являются условными, т.к. указанные значения рН достигаются только при соединении с равным объемом боратного буфера рН 9,0.
Растворы хранят при температуре 4*С. Из фосфатных буферов с рН 6,0 и 7,0 получают растворы с промежуточными рН, соединяя их в определенных соотношениях.
Альбумино-боратный буферный раствор (АББ) . Для приготовления этого раствора используют альбумин из бычьей сыворотки. АББ готовят в два этапа. Сначала готовят 4% раствор альбумина на боратном буфере. Для этого навеску альбумина растворяют в боратном буфере, тщательно перемешивают и оставляют для полного растворения на сутки при температуре 4*С, затем рН раствора, добавляя 1 М NaOH, доводят до 9,0. Этот раствор стерилизуют трехкратным прогреванием при температуре 56-58*С (по 30 мин в течение 3 дней подряд). АББ получают, соединяя 1 часть 4% раствора альбумина и 9 частей боратного буфера. Конечное значение рН АББ сравняется с 9,0. 0,4% раствор АББ готовят перед опытом и хранят при температуре 4*С не более 5-7 сут.
Взвесь (25%) каолина на боратном растворе с рН 9,0. К 100 мл боратного буфера добавляют 25 г каолина, перемешивают и фильтруют через двойной марлевый фильтр. Взвесь каолина хранят при температуре 4*С, перед использованием тщательно взбалтывают.
Раствор Альзовера используют как антикоагулянт при взятии эритроцитов гуся. Приготовление раствора описано в [ Шубладзе, 1954 ].
Декстрозо-желатино-вероналовый буферный раствор. Для его приготовления в 250 мл дистиллированной воды при температуре 65*С растворяют 0,6 г желатины, 0,58 г веронала и после их полного растворения добавляют (в указанном порядке) 0,38 г мединала, 0,036 г кальция хлорида, 0,12 г магния хлорида, 8,5 г поваренной соли, 10,0 г декстрозы. Раствор доводят дистиллированной водой до 1 л и стерилизуют автоклави-рованием в течение 10 мин при 0,7 атм; рН раствора должен быть 7,0-7,6.
Смотрите также:
