Реакция биологической нейтрализации: учет результатов
Опыты нейтрализации на белых мышах наблюдают в течение 2-3 нед. Титром вируснейтрализующих антител является то наибольшее разведение сыворотки, которое защищает не менее 50% животных, зараженных 100 ЛД(50) или 100 ТЦД(50). При учете реакции нейтрализации (РН) в культурах клеток (100 ТЦД(50)) титром антител считается наибольшее разведение сыворотки, при котором монослой клеток сохраняется не менее чем в 50% инфицированных лунках или наблюдается 50%-ная редукция числа бляшек. Опыты нейтрализации в клеточных культурах обычно проводят в сроки, когда в контрольных лунках регистрируют максимальные проявления цитопатогенного действия вируса при полной сохранности незараженного клеточного монослоя.
Определение индекса нейтрализации. При этой модификации метода испытуемые и контрольные сыворотки в одном разведении (1:5 или 1:10) соединяют в соотношении 1:1 с 10-кратными разведениями вируса. Обязательно включение в опыты таких контролей: титрование вируса в смеси с нормальной неиммунной сывороткой (или ИАЖ ) того же происхождения, что и иммунная, контроль неинфицированной клеточной культуры, контроль сывороток на токсичность для клеточных культур; контроль специфической нейтрализации вируса гомологичной иммунной сывороткой или ИАЖ.
Результаты реакции выражаются индексом нейтрализации: отношение титра вируса для данных культур клеток или животных в присутствии нормальной сыворотки к титру вируса в присутствии испытуемой или гомологичной сыворотки. Индексы можно выразить в логарифмах ЛД(50), ТЦД(50), БОЕ или соответствующим антилогарифмом, обозначающим это число арифметически.
Особенности постановки РН в клеточных культурах микрометодом. Эта реакция характеризуется высокой воспроизводимостью. Для ее постановки чаще всего используют 96- или 24-луночные пластиковые панели фирмы Linbro одноразового пользования со сформировавшимся монослоем клеток.
Результаты опытов учитывают, регистрируя цитопатогенное действие вируса под инвертируемым микроскопом. Можно использовать также способ заражения клеток во взвеси. При этом в лунки 24-луночных панелей со смесью вирус-сыворотка (0,1 мл) вносят по 0,5 мл суспензии клеток. Панели слегка встряхивают и инкубируют в течение 3-4 ч при температуре 37*С. По окончании инкубации в каждую лунку добавляют по 0,4 мл покрытия. В состав покрытия входит расплавленная карбоксиметилцеллюлоза (фирма Sigma, США) и минимальная среда Игла с 6% эмбриональной сыворотки коров и 0,7% глутамина (соотношение карбоксиметилцеллюлозы и питательной среды Игла - 1:1). Панели накрывают крышками и инкубируют при температуре 37*С в термостате с подачей СО2 в течение 2-6 сут, в зависимости от времени проявления цитопатического действия используемого вируса. Затем жидкость из каждой лунки удаляют, промывают фосфатным буферным раствором и в каждую лунку добавляют по 0,2-0,4 мл раствора нафталина черного. Для получения 100 мл этого раствора требуется 60 мл ледяной уксусной кислоты, 13,6 г ацетата натрия, 1 г нафталина черного. Смесь этих ингредиентов доводят до требуемого объема дистиллированной водой. Через 1-2 ч после обработки лунок красителем его отсасывают, лунки тщательно промывают водопроводной водой. Результаты учитывают по сформированным вирусом бесцветным бляшкам на фоне окрашенных в темно-фиолетовый цвет клеток. Возможен также учет реакции по развитию ЦПД .
Смотрите также:
