Секвенирование вирусных геномов: общие сведения
Данные о нуклеотидной последовательности генома являются наиболее полной молекулярно-биологической характеристикой вируса и позволяют точно идентифицировать исследуемый штамм, проанализировать степень родства с другими вирусами, а также отличить от практически идентичных вариантов того же вируса. В настоящее время для многих вирусов возможно воссоздание исходного штамма de novo, имея в распоряжении полную нуклеотидную последовательность генома. При этом полученный штамм ничем не будет отличаться от родителя, для которого были получены данные о полной нуклеотидной последовательности генома. Таким образом, имея данные о полной нуклеотидной последовательности генома вируса, исследователь способен определить его абсолютную идентичность или отличия, даже минимальные, от других вирусов, а в некоторых случаях и воссоздать исходный вирус.
Определение полной нуклеотидной последовательности вирусных геномов становится все более востребованным и популярным методом для наиболее полной молекулярно-биологической характеристики вирусов в связи с широким распространением автоматических секвенаторов, появлением ПЦР и, как следствие, драматическим снижением затрат на получение этих данных.
Два метода секвенирования ДНК были предложены в 1977 г. Первый, основанный на химической деградации ДНК с последующим анализом длины ДНК-фрагментов, называемый также по имени авторов методом Максама-Гилберта, в настоящее время используется крайне редко. Второй метод (метод Сэнгера), называемый методом терминации цепи, использует свойство ДНК-полимеразы прекращать синтез полимеризуемой цепи при встраивании в нее дидезоксирибонуклеотидов.
Принцип метода состоит в использовании двух основных положений.
Первое: если к ДНК-матрице добавить специфичный праймер, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты, ДНК-полимеразу и проводить реакцию в подходящих солевых и температурных условиях, то все синтезирующиеся de novo цепи ДНК будут начинаться с одинаковой стартовой точки.
Второе: если в такую смесь добавить какой-либо (из четырех возможных) дидезоксирибонуклеотид, например ддАТФ, то все растущие цепи будут специфически терминироваться после его внесения. В результате продукты реакции будут представлять собой набор одноцепочечных ДНК, начинающихся от одной точки и заканчивающиеся на ддАТФ.
Аналогично можно провести реакцию с терминированием цепи по трем другим нуклеотидам. Для идентификации данных, полученных таким способом, необходимо электрофоретическое разделение этих смесей фрагментов в условиях, позволяющих отличать сигналы индивидуальных фрагментов, различающихся по длине на один нуклеотидный остаток.
Важное значение для успешного проведения работ по определению нуклеотидной последовательности имеют качество и возможности используемого оборудования. Для проведения собственно секвенирования в настоящее время используется сравнительно небольшое количество аппаратов, различающихся фирмой-производителем и количеством проб, которое аппарат может проанализировать за один раунд электрофореза. Отлично зарекомендовали себя аппараты фирмы Applied Biosystems (США), количество капилляров в модели 4 или 16, при этом, среди моделей Applied Biosystems следует исключить для подобной работы крайние варианты с 1 и 96 капиллярами как предназначенные для других проектов (в первом случае количество капилляров недостаточно и будет лимитирующим фактором исследования, во втором - значительно превышает надобности проекта и предназначено для более масштабных исследований, таких как определение полной нуклеотидной последовательности геномов прокариот и эукариот). При выборе капилляров следует отдать предпочтение наиболее длинным (в случае аппаратов Applied Biosystems из предлагаемых вариантов 36, 50 и 80 см наиболее подходящими являются капилляры длиной 80 см), т.к. несмотря на увеличенное время одного анализа с каждой реакции удается получить больше данных.
Смотрите также:
