Создание дефектных мини-геномов РНК-содержащих вирусов
Дефектный мини-геном представляет собой делеционный вариант генома и в минимальном варианте может состоять из одних лишь концевых последовательностей генома, не неся в себе вирусных генов. Если на концах мини-генома сохраняются регуляторные элементы, необходимые для репликации, то при наличии в клетках вируса-помощника (полноценного родительского вируса) такой мини-геном не только размножается, но и упаковывается в дефектные вирусные частицы. Эти частицы в присутствии вируса-помощника являются инфекционными и в процессе пассирования в клеточных культурах зачастую размножаются в значительных титрах, обгоняя рост вируса-помощника. Распространенным типом мини-генома (на примере РСВ ) является молекула РНК, состоящая из частей, изображенных на рис. 2.52 .
Такой геном можно получить в лаборатории и ввести в клетки совместно с вирусом-помощником. Рассмотрим возможности, предоставляемые данной экспериментальной моделью. Как видно из приведенной выше схемы, в геном включен репортерный ген хлорамфениколацетилтрансферазы (CAT) , экспрессия которого может количественно измеряться как по синтезу мРНК данного гена, так и по ферментативной активности его продукта. Дополнительно есть возможность исследовать степень репликации всего мини-генома по количеству минус-цепей РНК, например, в реакции гибридизации нуклеиновых кислот со специфическими зондами. В сочетании с другими факторами данная модель позволяет ставить и экспериментально решать фундаментальные и практические задачи. К ним относится изучение cis-регуляторных последовательностей вирусного генома, факторов регуляции, синтез которых осуществляется in trans при одновременном заражении вирусом-помощником или введении экспрессирующих векторов.
Для изучения регуляторных элементов в геноме вируса, например промоторов, отвечающих за репликацию и транскрипцию, их изменяют в мини-геноме, вставляя готовые последовательности из хорошо охарактеризованных штаммов вируса, или изменяют нуклеотид за нуклеотидом, анализируя повышение или понижение промоторной активности. В практическом отношении такие эксперименты приводят к изучению механизмов аттенуации и к получению новых аттенуированных штаммов. Для изучения факторов вирусной репродукции, например репликативного комплекса, последовательность мини-геномов оставляют неизмененной, но заменяют вирусы-помощники, например вирулентный на аттенуированный. Изменение уровня репликации или экспрессии репортерного гена в мини-геноме в данном случае может означать связь компонентов репликативного комплекса с вирулентностью.
Для более глубокого изучения факторов репликации и транскрипции сегодня можно отказаться от вируса-помощника. Ряд белков, необходимых для функционирования мини-генома, вводят в клетки с помощью рекомбинантных плазмид с соответствующими генами и обеспечением их экспрессии. Происходит репликация мини-генома и экспрессия гена-репортера. В этом случае каждая из плазмид может быть подвергнута генетическим манипуляциям, что позволяет изменять аминокислотную последовательность факторов репликации и транскрипции и оценивать их функции в прямых экспериментах. Гипотезы относительно связи структуры РНК или белков с фенотипическими особенностями вируса могут быть подтверждены в опытах по введению комплементирующих мутаций в мини-геном или в белки репликазного комплекса.
Рассмотрим более сложную модель мини-генома, содержащую два репортерных гена (двуцистронный мини-геном), средняя часть которого приведена на рис. 2.53 .
Как видно на рис. 2.53 , вслед за геном CAT следует репортерный ген люциферазы (LUC) . Между ними встроена последовательность РНК так же, как два соседних вирусных гена связаны в геноме. Подобная организация мини-генома позволяет исследовать относительную экспрессию каждых двух соседних вирусных генов в зависимости от всех упомянутых выше факторов, а также от структуры межгенного участка.
Смотрите также:
