Создание полноценных инфекционных геномов РНК-содержащих вирусов
Геномы ряда РНК-содержащих вирусов инфекционны. Если выделить РНК из препарата очищенных вирионов и ввести в чувствительные к вирусу клетки методом липофектин-вой трансфекции или электропорации, то происходит синтез вирусных белков, после чего эти вирусные белки уже могут участвовать в процессе репликации и транскрипции генома, в сборке вирусных частиц. В результате образуется зрелый инфекционный вирус. Ряд вирусов (например, вирусы с РНК-геномом отрицательной полярности ) имеет неинфекционные геномы. Молекула РНК отрицательной полярности не способна к трансляции, т.е. не может выступать как информационная РНК. В отсутствие вирусных белков геномная РНК не может реплицироваться, образовывая плюс-цепь. Таким образом, геномная РНК в клетках не будет функциональна.
Тем не менее и для таких вирусов возможно создание в лабораторных условиях инфекционных РНК-геномов. В этом случае при синтезе генно-инженерными способами полного вирусного генома требуются дополнительные условия для сохранения его инфекционности. Инфекционность таких геномов обеспечивается с помощью одновременного введения в клетки вируса-помощника , или же функции вируса-помощника моделируются с помощью введения в клетки экспрессионных векторов, стимулирующих синтез необходимых вирусных белков (белков репликазного комплекса).
Рассмотрим технологические приемы, используемые при создании РНК-геномов. В основе данной технологии лежит получение двухцепочечной геномной копии ДНК методами обратной транскрипции и ПЦР . Из полученной ДНК методами генной инженерии собирают полную копию вирусного генома в виде клона в бактериальной плазмиде . На конце встроенного в плазмиду вирусного генома располагают последовательность промотора бактериофага Т7 : 5'-TTAATACGACTCACTATA-3'.
Первый нуклеотид (+1) в транскрипционной единице (геномной копии) вируса будет непосредственно примыкать к З'-концу промоторной последовательности. С противоположного конца вирусного генома встраивают последовательность, позволяющую перевести кольцевую молекулу плазмидной ДНК в линейную форму, разрезав ее точно на конце встроенного вирусного генома (такой последовательностью обычно служит или сайт узнавания рестрикционной эндонуклеазы, или саморасщепляющаяся последовательность рибозима). Таким образом, становится возможным синтез точной РНК-копии вирусного генома как положительной, так и отрицательной полярности. С помощью ПЦР in vitro с использованием РНК-полимеразы бактериофага Т7 на матрице данной рекомбинантной плазмиды синтезируют РНК и используют ее в качестве инфекционного начала, применяя электропорацию или липофектиновую трансфекцию чувствительных к вирусу эукариотических клеток. По другой технологии, трансфекцию осуществляют с помощью ДНК, а синтез инфекционной РНК происходит в клетках. Чем больше размер генома, тем сложнее задача по его воссозданию из-за нестабильности больших плазмид и повышенной вероятности неучтенных мутаций, внесенных на стадии синтеза кДНК и ее амплификации методом ПЦР.
Смотрите также:
