Ультратонкие срезы в электронной микроскопии
Чтобы исследовать ультраструктуру внутри клетки или вириона, необходимо сделать ультратонкий срез через исследуемый материал. Процедура, разработанная для подготовки такого материала, включает следующие этапы: 1) фиксация; 2) удаление воды; 3) введение жидкого полимера и полимеризация; 4) ультратомирование; 5) окрашивание срезов.
Фиксация. Для получения препаратов ультратонких срезов исследуемый материал - кусочки тканей или осадки клеточных культур - размером 1,0-1,5 мм фиксируют в два этапа: сначала предфиксация 2,5% раствором глутаральдегида на 0,15М фосфатном буфере, а затем фиксация 1% раствором OsО4 на фосфатном буфере в течение 40 мин в холодильнике.
Удаление воды. После отмывки от фиксатора в фосфатном буфере материал обезвоживают в серии спиртов повышающей концентрации от 50 до 96% в течение 20 мин в холодильнике; затем обезвоживание проводят в 100% спирте по 20 мин при комнатной температуре.
Введение жидкого полимера и полимеризация. Для получения твердых и упругих блоков, пригодных для резки на ультратоме, используют полимерные эпоксидные смолы ("Аралдит", "Эпон") или водорастворимые смеси. Процесс пропитки и заливки материала в эпоксидную смолу занимает 1-2 сут. Кусочки тканей или осадков переносят в пластиковые капсулы или плоскопараллельные пластинки и заливают смесью смолы. Полимеризация блоков проходит при температуре 60*С в термостате в течение 48 ч.
Ультратомирование. Для получения ультратонких срезов конец блока с заключенным в нем материалом затачивают в виде пирамидки, вершиной которой является трапеция или четырехугольник. Срезы с вершины пирамидки получают на ультратоме с помощью алмазного ножа. Ванночку заполняют дистиллированной водой, а полученные срезы толщиной 300-350 Е наносят на гальванические сетки, покрытые формваровой пленкой.
Окрашивание срезов. Контрастирование сетки со срезом проводят в 5% растворе уранилацетата на 70% метаноле, погружая в каплю раствора в течение 15-20 мин. Затем промывка сетки несколькими сменами дистиллированной воды. Окрашивают сетки со срезами цитратом свинца в течение 10-15 мин на поверхности капли раствора.
Смотрите также:
