Этапы секвенирования вирусных геномов
Несмотря на большое разнообразие вирусов и весьма различные проблемы, с которыми может столкнуться исследователь при секвенировании генома, можно сформулировать некоторые общие подходы и правила, которые необходимо соблюдать для повышения эффективности и минимизации затрат при определении полной нуклеотидной последовательности вирусных геномов.
Первым этапом подобной работы всегда является сбор всей доступной информации о вирусном штамме, для которого предполагается определить полную нуклеотидную последовательность генома. Эту работу можно условно разделить на три части.
1. Сбор общих сведений о вирусе, исходя из его принадлежности к семейству: размер генома, ДНК или РНК, фрагментирован ли геном? Таксономическое положение вируса и данные о его ближайших родственниках, принадлежащих к этому же роду или антигенной группе.
2. Анализ сведений о конкретном штамме или изоляте, с которым предстоит работать. Обычно это данные по иммунологическому типированию, исходя из которых данный вирусный изолят и был отнесен к определенной группе вирусов, иногда данные электронной микроскопии, позволившие определить принадлежность вируса к определенному семейству, реже - частичная нуклеотидная последовательность генома, определенная ранее.
3. Сбор данных по доступным для исследователя нуклеотидным последовательностям генома вируса. Для выполнения этой задачи необходимо добыть практически все известные полные, а иногда и частичные последовательности геномов вируса. Это позволит ответить на несколько важных и определяющих дальнейшую стратегию работы вопросов. Во-первых, насколько представительна база нуклеотидных последовательностей вируса? Для одних вирусов, таких как вирус гриппа или ВИЧ, это могут быть сотни и тысячи последовательностей. Для других - единицы, они могут и вовсе отсутствовать в базе данных. В последнем случае придется отталкиваться от известных последовательностей родственных вирусов, что значительно усложнит предполагаемую работу. Фактически в пункте третьем необходимо определиться с последовательностью(ями) на основании которой(ых) будут подбираться праймеры для проведения ПЦР и секвенирования.
В результате первого этапа работы должна быть подобрана последовательность или группа последовательностей, максимально гомологичных той, определение которой является задачей исследования. В одном случае это может быть последовательность генома из штамма практически идентичного вируса, в другом - группа геномных последовательностей от других генотипов того же вируса и, наконец, в третьем - последовательности геномов родственных вирусов.
Вторым этапом является выбор оптимального размера перекрывающихся фрагментов ПЦР, содержащих полный геном исследуемого вируса. Поскольку в подавляющем большинстве случаев в руках у исследователя находится вируссодержащий материал с достаточно невысоким титром вируса, то практически всегда необходимо использовать ПЦР для выполнения работы по определению полной нуклеотидной последовательности вирусного генома. Следует отметить, что за основу берут расчеты, исходя из проведения однораундовой ПЦР. В случае, если фрагмент удается получить только в варианте "nested" или "seminested", работа по определению полной нуклеотидной последовательности вирусного генома настолько усложняется, что разумнее попытаться повысить качество исходного материала другими методами, такими как получение большего количества исходного вируссодержащего материала, предварительное концентрирование и очистка вируса.
Для эффективного выполнения этого этапа необходимо проанализировать возможности имеющихся в распоряжении исследователя реагентов и аппаратов, т.е. провести предварительные опыты и ответить на два основных вопроса.
1. Какой максимальный размер фрагмента ПЦР воспроизводимо получается при использовании имеющихся реагентов, наборов и аппаратов на матрице ДНК или кДНК исследуемого вируса? Понятно, что на результат будет влиять качество исходного препарата, степень очистки и титр вируса, а кроме того, удача в выборе праймеров для ПЦР.
2. Какую среднюю длину последовательности удается достоверно определить на имеющемся в распоряжении исследователя автоматическом секвенаторе при использовании в качестве матрицы ПЦР-фрагмента?
Третьим этапом работы является собственно подбор праймеров для проведения ПЦР и дальнейшего секвенирования. При этом нужно исходить из данных, полученных на двух первых этапах работы, учитывая некоторые небольшие технические нюансы, которые дадут о себе знать на конечном этапе сборки последовательности.
Оптимальное перекрывание фрагментов ПЦР - около 200 н.о., что связано с тем, что при секвенировании не прочитывается последовательность праймера и еще 30-50 н.о. непосредственно за ним. При большем перекрывании фрагментов ПЦР потребуется увеличение их количества и, соответственно, увеличение затрат. Оптимальный размер фрагмента ПЦР для проведения дальнейшей работы - это максимальный размер, который можно получить при постановке ПЦР. Всегда удобнее и быстрее работать с одним большим фрагментом, чем с набором маленьких, содержащих в сумме ту же последовательность.
Смотрите также:
.gif)