Картирование физическое: прогулки по хромосоме, прыжковая и связывающие библиотеки
Многие гены в геноме эукариот располагаются в виде кластеров, члены которых функционально или эволюционно связаны друг с другом. В связи с этим в молекулярной генетике часто возникает задача клонирования генов, расположенных по соседству с уже выделенными генами. Для ее решения был разработан метод "прогулки по хромосоме". Из клонотеки генов , полученной на основе фаговых или космидных векторов , выделяют ген и короткие 5'- и 3'- концевой фрагменты его последовательности используют в качестве зондов для поиска фрагментов ДНК, перекрывающихся с этим геном. Основным требованием, предъявляемым к зонду, является принадлежность его к уникальной последовательности нуклеотидов, т.е. встречающейся в геноме только один раз. С использованием такого подхода были исследованы многие кластеры эукариотических генов, в частности, бета-глобинового локуса человека , структура которого представлена на рис. II.14 .С помощью "прогулки по хромосоме" удается детально картировать участки ДНК длиной до 250 т.п.о.
Прыжковые и связывающие библиотеки.
Метод "прыжков по хромосоме" позволяет стыковать за один прием фрагменты ДНК общей длиной от 100 до 500-1000 т.п.о. На первом этапе препарат высокомолекулярной ДНК расщепляют соответствующей рестриктазой и с помощью электрофореза в импульсном электрическом поле получают фракцию фрагментов ДНК одинакового размера ( рис. II.15 ). Затем фрагменты ДНК лигируют с маркерным геном, например, геном устойчивости к антибиотикам , что приводит к образованию кольцевых молекул. Кольцевые молекулы ДНК расщепляют другой рестриктазой, для которой отсутствуют сайты рестрикции в маркерном гене, что сопровождается образованием коротких фрагментов ДНК, которые далее можно клонировать обычными способами. Полученную клонотеку фрагментов ДНК исследуют с использованием гибридизации с зондом, комплементарным точке начала "прыжка по хромосоме". Отобранные в результате гибридизации клоны содержат маркерный ген, фланкированный изучаемыми последовательностями нуклеотидов, удаленными друг от друга на 100 т.п.о. Таким образом, получают информацию о последовательностях нуклеотидов, удаленных от точки начала "прыжка по хромосоме" на 100 т.п.о., и эти последовательности далее используют в качестве зонда для выделения и исследования фланкирующих ее фрагментов ДНК.
Методической основой для таких работ послужила идея, высказанная F. Collins и S. Weissman в 1984 г. [ Collins F. e. a., 1984 ]. Суть ее заключается в том, что клонируются только концы протяженных фрагментов ДНК, а весь остальной материал удаляется. Это происходит за счет того, что длинные фрагменты геномной ДНК циркуляризуют, а затем расщепляют другой рестриктазой и клонируют в подходящий вектор. Таким образом, полученная библиотека содержит фрагменты, представляющие собой соединенные вместе концы длинных фрагментов геномной ДНК (см. рис. II.15 ). Однако, широкое применение этого метода затруднялось отсутствием простого и удобного метода получения протяженных фрагментов геномной ДНК и разделения их. После открытия метода пульс-фореза и редкощепящих рестриктаз положение радикально изменилось. Практически одновременно A. Poustka с соавт. [ Poustka A. e. a., 1987 ] и F. Collins с соавт. [ Collins F. e. a., 1986 ], предложили использовать редкощепящие рестриктазы для получения двух библиотек, одна из которых ("связывающая" ("linking")) состоит из клонов, содержащих сайт расщепления редкощепящих рестриктаз, а другая ("прыгающая" ("jumping")) состоит из фрагментов, расположенных на концах рестриктных фрагментов , образуемых при расщеплении геномной ДНК (рис. 1.1).
Связывающие библиотеки широко применяются для построения рестриктных карт хромосом. Достоинством этого метода является то, что позволяя доказать соседство двух рестриктных фрагментов, они позволяют получать полные рестриктные карты хромосом при использовании относительно небольшого числа клонов [ Smith C.L. e. a., 1986 , Smith C.L. e. a., 1987 ]. Так, например, полный набор NotI-связывающих клонов для хромосомы 21 состоял бы из 50 клонов [ Zhu Y. e. a., 1993 ]. При этом создание и анализ такой библиотеки дает дополнительную информацию, превращая просто рестриктную карту в карту рестриктных сайтов-STS ( STARS от Sequence Tagged Are Restriction Sites по терминологии [ Zhu Y. e. a., 1993 ]).
При анализе "связывающей" и "прыгающей" библиотек, полученных из одного района генома, можно однозначно реконструировать порядок расположения рестриктных сайтов. Действительно, если в "связывающей" библиотеке клонированная ДНК перекрывает рестриктный сайт, а в "прыгающей" состоит из половинок, находящихся на противоположных концах рестриктных фрагментов, то при секвенировании достаточного количества клонов из обоих библиотек можно путем сравнения последовательностей определить порядок взаимного расположения рестриктных сайтов в геномной ДНК. Именно этот подход лег в основу проекта изучения 3й хромосомы в России .
Смотрите также:
