Ген ob: картирование
В конце 50-х годов ген ob был картирован в проксимальной части хромосомы 6 мыши [ Dickie M.M., Lane P.W., 1957 ].
Дальнейшее его картирование основывалось на использовании метода позиционного клонирования и поиске генов, активно экспрессируемых в жировой ткани [ Zhang Y., ea, 1994 ]. В этих исследованиях позиционное клонирование проводили с помощью искусственных хромосом дрожжей (yeast artificial chromosomes, YAC ).
Ген ob, расположенный внутри интервала 650 т.п.о. хромосомы 6, выделяли с использованием метода захвата экзонов ( exon trapping ) [ Church D.M., 1994 ]. С этой целью индивидуальные или объединенные клоны субклонировали в экзон-захватывающем векторе pSPL3 по сайтам BamH I/BglII, затем их секвенировали и сравнивали нуклеотидные последовательности со всеми последовательностями из Gen Bank. Скрининг мРНК, комплементарных предполагаемым экзонам проводили в различных тканях с помощью нозерн- блотинга и совмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР. В результате было отобрано и идентифицировано шесть потенциальных клонов, из которых четыре картированы внутри 650 т.п.о. области оb.
Один из захваченных экзонов (2G7), гибридизовался только с мРНК из белой жировой ткани и не гибридизовался с РНК других тканей мыши. Использование cовмещенной реакции обратной транскрипции и ПЦР дало аналогичные результаты. Высокий уровень экспрессии экзона в жировой ткани позволил сделать заключение о его возникновении из гена ob, что подтверждалось отсутствием экспрессии экзона 2G7 в жировой ткани мышей линии SM/Cke-+Dacob2J/ob2J, у которых ген ob не функционирует. С помощью экзона 2G7 из клонотеки кДНК, полученной на основе мРНК из жировой ткани нормальной мыши, были отобраны 22 комплементарных клона ДНК и проведено их секвенирование. В результате была определена нуклеотидная последовательность кДНК гена ob , которая содержала открытую рамку считывания для белка из 167 аминокислотных остатков и очень длинную 3'-нетранслируемую область [ Zhang Y., ea, 1994 ]. В части клонов кДНК гена ob (30%) отсутствовал кодон остатка глутамина в положении 49 пептида, что могло быть вызвано удалением 3 нуклеотидов (CAG) из мРНК ob в результате альтернативного сплайсинга, вызванного присутствием последовательности AG (специфическое место сплайсинга) в кодирующем глутамин кодоне CAG.
Смотрите также:
