Матрикс ядерный: взаимодействие с ДНК, методы исследования
Ядерный матрикс был впервые выделен Berezney and Coffey в 1974 году из печени крысы, а вслед за этим из многих других объектов. Существует две основных группы методов, позволяющих выделять ядерный матрикс и исследовать его взаимодействие с ДНК, т.е. исследовать связи между функциональным строением генома и петлевой организацией хроматина.
Первая группа методов основана на действии на изолированное ядро неионных детергентов и буфера с высокой ионной силой. ДНК, не связанную с матриксом, отделяют путем многократных промываний раствором с высокой концентрацией соли ( Berezney R. and Coffey D.S., 1974 ).
Вторая группа методов основывается на действии 3,5-дийодосалицилата лития ( LIS ) как хаотропного агента и детергент а без применения высокосолевого буфера ( Mirkovitch J. ea, 1984 ).
Несмотря на то, что экстракция высококонцентрированными солевыми растворами является традиционным методом изоляции ядерного матрикса, многие исследователи подвергают его критике из-за наличия различных артефактов. Таких, например, как перестройка ядерного материала в процессе экстракции, осаждение транскрипционных комплексов и т.д. ( Razin S.V. and Vassetzky Y.S., 1992 ).
Был разработан ряд других процедур, позволяющих исследовать взаимодействие ДНК с ядерным (хромосомным) скелетом. Из них метод LIS- экстракции получил наибольшее распространение ( Razin S.V. and Vassetzky Y.S., 1992 , Mirkovitch J. ea, 1984 ).
Необходимо добавить, что отделение ассоциированной с ядерным матриксом ДНК осуществляется путем многократных промывок рестриктным буфером, и для фрагментации ДНК часто применяются ферменты рестрикции. Данный метод обладает тем преимуществом, что взаимодействия, наблюдаемые таким образом, не обязательно должны быть устойчивы к действию высокой ионной силы. Связывающиеся с нуклеоскелетом фрагменты ДНК образуют в этом случае некоторый набор последовательностей, обнаруживающих специфическое взаимодействие с изолированным ядерным матриксом (причем он может быть изолирован и методом высокосолевой экстракции) ( Mirkovitch J. ea, 1984 ; Gasser S.M., Laemmli U.K., 1986 ). Также на специфическое взаимодействие с матриксом in vitro может быть проверен любой набор фрагментов клонированной геномной ДНК ( Gasser S.M., Laemmli U.K., 1986 ).
Основной вопрос, возникающий в связи с использованием связывания с матриксом in vitro заключается в том, существуют ли сайты связывания матрикса с ДНК такого типа в ядре до экстракции, или они образуются de novo в течении экстракции ядер и их обработки нуклеазами.
Смотрите также:
