Микроскопия микобактерий
Микроскопия мокроты - сравнительно быстрый, простой и недорогой метод, который должен быть использован во всех случаях при подозрении на туберкулез. Кроме того, это исследование проводят для оценки эффективности химиотерапии и для констатации выздоровления или неудачного исхода лечения при отсутствии результатов культурального исследования.
Используют 2 метода микроскопического исследования:
- метод прямой микроскопии, когда мазок готовят непосредственно из диагностического материала;
- метод микроскопии осадка, подготовленного из обработанного деконтаминантами материала для культурального исследования.
Первый метод используют в тех лабораториях, где проводят только микроскопические исследования (клинико-диагностические лаборатории общей лечебной сети).
Лучшие результаты микроскопического исследования получают при концентрировании диагностического материала (например, центрифугированием).
Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза с вероятностью 50% при проведении микроскопии, 1 мл мокроты должен содержать более 5000 микробных клеток. Мокрота пациентов с легочными формами туберкулеза обычно содержит значительное количество кислотоустойчивых бактерий, что позволяет уверенно выявить их при бактериоскопии. Диагностическую чувствительность этого метода можно повысить, если исследовать несколько образцов мокроты от одного пациента. Отрицательный результат бактериоскопического исследования не исключает диагноза туберкулеза, поскольку мокрота некоторых пациентов содержит меньше микобактерий, чем можно выявить с помощью микроскопии. Плохая подготовка мазков мокроты также может быть причиной отрицательного результата бактериоскопического исследования.
Наиболее распространенный метод для выявления кислотоустойчивых мико-бактерий в мазке - окраска по Цилю-Нельсену . Метод основан на проникновении карболового фуксина в микробную клетку через мембрану, включающую в себя восково-липидный слой, при одновременном воздействии нагревания и сильного протравливающего действия фенола. Последующее обесцвечивание мазка 25% раствором серной кислоты или 3% солянокислым спиртом приводит к обесцвечиванию всех некислотоустойчивых структур. Обесцвеченные элементы мазка докрашивают 0,3% раствором метиленового синего. Микобактерии не воспринимают обычные анилиновые красители, в результате чего кислотоустойчивые микобактерии окрашиваются в малиново- красный цвет, а другие микробы и клеточные элементы - в голубой.
Для исследования мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену, используют световой бинокулярный микроскоп с иммерсионным объективом (90- или 100- кратное увеличение) и окуляром с 7- или 10-кратным увеличением. Исследуют 100 полей зрения, что достаточно для выявления в мазке единичных микобактерий. В том случае, если результат такого исследования отрицательный, для подтверждения рекомендуют просмотреть еще 200 полей зрения. Регистрируют результаты, указывая количество обнаруженных кислотоустойчивых микобактерий (КУМ) .
Помимо данной методики, применяют окраску флюорохромами для люминесцентной микроскопии, что позволяет достичь наилучших результатов. Применение этого метода повышает эффективность микроскопии на 10-15%. При обработке микобактерий люминесцентными красителями (аурамин, родамин и др.) эти вещества также связываются с воскоподобными структурами микробной клетки. При облучении окрашенных клеток возбуждающим источником света (определенный спектр ультрафиолетового излучения) они начинают светиться оранжевым или ярко-красным светом на черном или темно-зеленом фоне. В связи с высокой яркостью и контрастностью видимого изображения можно снизить общее увеличение микроскопа в 4-10 раз, чем расширяется поле зрения и уменьшается время просмотра препарата. Наряду с этим за счет значительно большей глубины резкости можно повысить комфортность исследования.
При использовании флюоресцентной микроскопии на просмотр той же площади мазка затрачивают значительно меньше времени, чем при световой микроскопии мазков, окрашенных по Цилю-Нельсену. Если за рабочий день микроскопист просматривает примерно 20-25 таких мазков, то с помощью флюоресцентной микроскопии он может исследовать за то же время более 60-80 образцов. Опытные микроскопист знают, что окраска клеток смесью аурамина и родамина является в некотором роде специфической для кислотоустойчивых микобактерий, которые в этом случае имеют вид золотистых палочек. Сапрофиты окрашиваются в зеленоватый цвет ( рис. 13-2 ).
Другое важное преимущество метода флюоресцентной микроскопии - возможность обнаруживать измененные микобактерии, утратившие под влиянием ряда неблагоприятных факторов, в частности интенсивной химиотерапии, свойство кислотоусотойчивости и не выявляющиеся в связи с этим при окраске по Цилю-Нельсену ( рис. 13-3 ).
К недостаткам метода флюоресцентной микроскопии относят сравнительно высокую стоимость микроскопа и его эксплуатации. Однако в централизованных или других крупных лабораториях, где нагрузка превышает норму 3 лаборантов, работающих с тремя обычными микроскопами, дешевле использовать вместо этого один флюоресцентный микроскоп.
Бактериоскопические методы обладают довольно высокой специфичностью (89-100%). Около 97% положительных результатов, полученных любым методом микроскопии, однозначно подтверждаются результатами посева.
Необходимо отметить, что при микроскопическом исследовании мазка патологического материала нельзя определить видовую принадлежность выявленных кислотоустойчивых микобактерий. Метод микроскопии позволяет дать заключение лишь о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микроорганизмов, что объясняется существованием в природе большого числа морфологически сходных с микобактериями туберкулезного комплекса нетуберкулезных кислотоустойчивых микроорганизмов.
Оценку результатов микроскопии производят в полуколичественных единицах ( табл. 13-1 ).
Для того чтобы можно было сравнивать результаты различных методов микроскопии, вводят эмпирические коэффициенты. Например, чтобы сопоставить результаты исследования мазка, окрашенного флюоресцентными красителями, с данными исследования световой микроскопии (1000-кратное увеличение), необходимо разделить количество кислотоустойчивых микобактерий, обнаруженных с помощью люминесцентного микроскопа, на соответствующий коэффициент при 250-кратном увеличении микроскопа - на 10, при 450-кратном - на 4, при 630-кратном - на 2.
Смотрите также:
