Принципы и возможности метода ПЦР (полимеразной цепной реакции)
ПЦР позволяет амплифицировать (размножить) в пробирке нуклеотидную последовательность (фрагмент ДНК возбудителя) в течение нескольких часов в миллионы раз. Проведение реакции при наличии единичных цепей ДНК определяет исключительно высокую чувствительность анализа.
Нуклеотидная последовательность определенных участков в цепи ДНК определяет генетическое своеобразие микроорганизма, что объясняет высокую специфичность ПЦР.
Значение этого метода для обнаружения и исследования характеристик микобактерий туберкулеза обусловлено биологическими особенностями микроорганизма, обладающего очень медленным ростом: время удвоения ДНК микобактерий туберкулеза при их культивировании составляет 12-24 ч.
Принцип метода ПЦР состоит в амплификации - многократном, в миллионы раз, умножении участков специфической последовательности ДНК в пробирочном микрообъеме при циклическом повторении следующих трех стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:
I стадия - денатурация двухцепочечной ДНК при нагревании с расхождением еецепей;
II стадия - комплементарное связывание (гибридизация) праймеров (затравочных олигонуклеотидов) с концевыми участками цепей строго специфического, избранного для умножения фрагмента ДНК;
III стадия - достройка цепи фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.
Для амплификации в пробирке должны быть молекулы матричной ДНК. четыре вида дезоксинуклеозидтрифосфатов ( нуклеотидов ), содержащих соответствующие азотистые основания: аденин (А) , тимин (Т) , гуанин (Г) , цитозин (Ц) ; искусственно синтезированные затравочные олигонуклеотиды (праймеры), состоящие из 18-20 пар оснований; термостабильный фермент ДНК-полимераза , имеющий температурный оптимум 68-72*С, и ионы магния.
Специфичность ПЦР зависит от выбора фрагмента ДНК. В соответствии с ним синтезируют фланговые затравочные олигонуклеотиды. Специфичность гибридизации и достройки цепи ДНК обусловлена принципом комплементарности следующих пар азотистых оснований: аденин-тимин, гуанин-цитозин.
Для определения генома микобактерий туберкулезного комплекса наиболее эффективной мишенью амплификации в большинстве тест-систем избран фрагмент ДНК IS6110, который в большинстве штаммов микобактерий туберкулеза имеет в геноме значительное число (10-20) повторов, что обеспечивает, наряду со специфичностью, высокую чувствительность анализа. В то же время описаны штаммы микобактерий туберкулеза с малым числом повторов или отсутствием фрагмента IS6110. Схематически ПЦР представлена на рис. 13-7 .
Смотрите также:
