ПЦР, биочипы: определение лекарственной чувствительности микобактерий
Задачи молекулярно-генетических методов определения лекарственной чувствительности или устойчивости микобактерий туберкулеза сводятся к выявлению мутаций в определенных нуклеотидных последовательностях известных генов. Основные методы основаны либо на прямом прочитывании (секвенировании) этих последовательностей после амплификации, либо на гибридизации биотин-меченых фрагментов ДНК, амплифицированных в ходе ПЦР с ДНК-зондами. Оба варианта предполагают выявление замен в нуклеотидных последовательностях, которые при использовании ДНК-зондов приводят к отсутствию или неполноценной гибридизации на нитроцеллюлозной мембране с помощью ферментного конъюгата (стрептавидин-щелочная фосфатаза) - метод LIPA-Rif-TB .
Метод измерения флюоресценции в локально фиксированных на микроучастках ДНК-зондах, комплементарных к известным мутациям в амплифицированных с помощью ПЦР участках генов, ответственных за лекарственную чувствительность или устойчивость, получил название метода микробиочипов. Основной алгоритм проведения этого исследования следующий. После выделения ДНК из клинического образца или культуры микобактерий необходимо провести ПЦР для амплификации соответствующих фрагментов rpoB гена , ответственного за лекарственную чувствительность к рифампицину , или katG и inhA генов , кодирующих белки микобактерий, ответственные за чувствительность к изониазиду . Результаты ПЦР оценивают с помощью агарозного гельэлектрофореза, при котором подтверждают получение соответствующих фрагментов ДНК искомой длины. Затем проводят 2-й раунд ПЦР для введения в ДНК флюоресцентной метки. Результаты ПЦР вновь подтверждают при гельэлектрофорезе. После этого проводят гибридизацию (инкубация в течение ночи) с последующей отмывкой полученного материала на биочипе, который представляет собой большое число фиксированных на маленькой стеклянной пластинке коротких цепей ДНК (зондов), комплементарных к нуклеотидным последовательностям чувствительного к лекарствам типа микобактерий туберкулеза в точках возможных мутаций, а также к мутантным последовательностям, ответственным за лекарственную устойчивость. Расположение ДНК-зондов на пластинке - строго определенное, а уровень наблюдаемой флюоресценции при гибридизации для определения результата с помощью специального считывающего устройства установлен. В связи с этим результаты анализа определяются с помощью специальной компьютерной программы.
Результаты применения этого метода для обнаружения лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду представлены на рис. 13-12 .
В последние годы развиваются и альтернативные методы определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза на основе технологии ПЦР в реальном времени , позволяющие проводить эти исследования в режиме закрытой пробирки.
На рис. 13-13 представлен результат анализа клинических культур микобактерий туберкулеза при определении лекарственной устойчивости к рифампицину с помощью ПЦР в реальном времени: 218 - контрольный образец (чувствительный к рифампицину); 93 - положительный контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; 4482 - положительный контроль на мутацию Ser-Leu TCG- TTG; 162-322 - экспериментальные образцы. Результат расчета кинетических кривых амплификации по 4 каналам: канал 1: 393 - положительный контроль на мутацию Ser-Trp TCG-TGG; канал 2: 4482 - положительный контроль на мутацию Ser-Leu TCG-TTG; 162, 163, 172, 295 - экспериментальные образцы; канал 4: кинетические кривые амплификации всех образцов, участвующих в эксперименте. Положительный контроль реакции амплификации. Выводы: по результатам анализа выявлены следующие мутации, определяющие устойчивость к рифампицину: в образцах 162, 163, 172, 295 - Ser-Leu TCG- TTG. Этот же принцип использован для определения лекарственной устойчивости к изониазиду по генам katG и inhA , определяющим наиболее частые мутации.
Смотрите также:
