ПЦР в реальном времени: общие сведения
Одним из самых современных вариантов метода является ПЦР в реальном времени. Название отражает общий смысл новой модификации. ПЦР в реальном времени основана на количественной детекции флюоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. Следовательно, результат ПЦР в реальном времени можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Исторически существует два основных метода флюоресцентного определения количества ампликонов:
1) использование химических агентов, неспецифически связывающихся с ДНК;
2) использование флюоресцентных зондов (TagMan зонды и молекулярные маяки (molecular beacons) или их называют "молекулярными скорпионами" (molecular scorpions).
Неспецифические красители связываются с двойной спиралью ДНК и не связываются с односпиральными молекулами ( рис. 2.46 ). Наиболее известным и широко используемым является краситель SibrGreenl.
При добавлении в реакционную смесь краситель SibrGreenl связывается с молекулами двуспиральной ДНК и интенсивность флюоресценции возрастает. В процессе денатурации краситель SibrGreenl отделяется от цепи ДНК и интенсивность флюоресценции падает. На стадии полимеризации или наращивания цепи краситель снова начинает связываться с продуктом ПЦР. После завершения полимеризации краситель SibrGreenl полностью связывается с нуклеиновой кислотой, что приводит к резкому возрастанию интенсивности флюоресценции.
Неспецифические красители универсальны, и их можно использовать для постановки различных ПЦР с довольно высокой чувствительностью. Недостатки использования таких красителей: 1) нельзя разделить неспецифическое связывание праймера и неспецифические фрагменты от специфических амплификатов; 2) более длинные амплификаты дают более сильный сигнал; 3) можно использовать только для одиночных ПЦР.
Дальнейшее совершенствование метода флюоресцентной детекции привело к созданию флюоресцентных зондов .
Сначала использовали так называемые молекулярные маяки, которые содержат флюорофор (FAM, TAMRA, ТЕТ, ROX) и гаситель флюоресценции (DABCYL) на любом конце молекулы. В свободном состоянии "молекулярные маяки" образуют шпильку (структура, когда 5'- и З'-концы зонда гибридизуются между собой). Спектр испускания флюорофора совпадает со спектром поглощения гасителя, и при возбуждении флюоресцентного красителя вместо флюоресценции будет происходить передача энергии на гаситель. После гибридизации на матрице, расстояние между флюорофо-ром и гасителем увеличивается и флюоресценция восстанавливается ( рис. 2.47 ).
В процессе реакции флюоресцентный сигнал возрастает и коррелирует с количеством ПЦР-ампликона. Появляется дополнительная возможность разработки множественной ПЦР. Однако возрастание флюоресцентного сигнала не прямо пропорционально количеству ампликонов.
Этот недостаток был исключен с использованием TagMan-зондов . Это короткие одноцепочечные ДНК размером 10-17 н.о., синтезированные химическим путем. В настоящее время, когда говорят о ПЦР в реальном времени, имеют в виду именно использование TagMan-зондов. Современная тест-система ПЦР в реальном времени содержит не только пару праймеров, но и дополнительный TagMan-зонд, комплементарный внутреннему участку фрагмента. К зонду ковалентно пришиты два химических соединения или две молекулы: на 5'-конце флюоресцентная метка (так называемый репортер), она испускает флюоресценцию; на З'-конце присоединен гаситель флюоресценции, который гасит флюоресценцию флюоресцирующей молекулы. Когда Taq ДНК-полимераза продвигается по одноцепочечной матрице, то, достигнув зонда, расщепляет его. При этом расстояние между флюоресцентной меткой и гасителем флюоресценции увеличивается, флюоресценция больше не гасится. Регистрируя интенсивность свечения, исследователь может узнать о ходе реакции без дополнительной стадии - электрофореза ( рис. 2.48 ).
Если рассмотреть кривую амплификации, можно выделить три участка:
1) с высокой постоянной эффективностью амплификации;
2) когда эффективность амплификации уменьшается;
3) величина флюоресценции постоянная.
Смотрите также:
