ПЦР: туберкулез, методы детекции результатов
После завершения реакции амплифицированные фрагменты ДНК возбудителя идентифицируют с помощью различных методов.
Хорошо известен метод гельэлектрофореза. При этом полученный фрагмент ДНК идентифицируют по положительному контролю, содержащему искомый специфический фрагмент ДНК, или по заранее известному размеру (числу нуклеотидных пар) фрагмента, который определяют с помощью стандартного молекулярного маркера.
В присутствии специфического красителя - этидия бромида, включающегося в двухцепочечную ДНК, синтезированный фрагмент ДНК выявляется в виде светящейся под действием ультрафиолета полосы.
Размер фрагмента ДНК, определяемый при электрофорезе по расстоянию пробега от старта, должен соответствовать известному маркеру молекулярного веса или положительному контролю.
Другие методы определения результатов ПЦР основаны на гибридизации одноцепочечных продуктов ПЦР с комплементарным к ним олигонуклеотидом - ДНК-зондом, меченным биотином, с последующей детекцией с помощью ферментативной реакции посредством, например, связывания с биотином конъюгата стрептавидин-щелочная фосфатаза.
На основе такого типа детекции созданы ПЦР-анализаторы , в которых детекция результатов ПЦР проводится автоматически в результате считывания оптической плотности в образцах после проявления ферментативной реакции.
Недостатки указанных методов заключаются в возможностях внутрилабораторной контаминации довольно короткими фрагментами молекул ДНК. Эти молекулы при попадании во вновь исследуемые образцы становятся матрицей для ПЦР и приводят к ложноположительным результатам.
В связи с этим для предотвращения ложноположительных результатов вводятся жесткие правила разделения и изолирования помещений для выделения ДНК из биологических образцов, помещения для детекции результатов (электрофорезная) от чистой зоны. Эти помещения представляют собой зону вероятной контаминации. Другая изолированная зона - чистое помещение для внесения исследуемых образцов ДНК в пробирки с реакционной смесью для проведения ПЦР. И наконец, предполагается, что основной прибор "ДНК-амплификатор" должен быть вынесен в отдельное, возможно офисное, помещение.
Для предотвращения контаминации продуктами предшествующих реакций - ампликонами некоторые ПЦР-тест-системы вместо дезоксинуклеозидтимидина содержат дезоксинуклеозидуридин, который при синтезе цепи in vitro встраивается вместо него в соответствующую позицию, т.е. азотистое основание тимин , присутствующий в нативной ДНК, замещается на урацил . Урацил-ДНК-гликозилаза , добавляемая в реакционную смесь к анализируемому материалу, разрушает только контаминирующие фрагменты с дезоксиуридином, но не нативную анализируемую ДНК, содержащую дезокситимидин. Последующее прогревание при 94*С инактивирует этот фермент и не препятствует амплификации в ПЦР.
Существует тест-система, основанная на изотермальной амплификации рРНК , для чего проводят вначале обратную транскрипцию и синтез молекул ДНК, являющихся, в свою очередь, матрицей для последующего синтеза молекул РНК. Ампликоны РНК детектируются с помощью окрашенного акридином ДНК-зонда при гибридизации в растворе реакционной пробирки. Этот метод, помимо высокой чувствительности, имеет преимущество проведения анализа в одной пробирке, что предотвращает контаминацию. По данным авторов, чувствительность этого метода в респираторных образцах достигает 90% при специфичности 99-100%.
Новые методы детекции реализованы в ПЦР в режиме реального времени . Эти методы отличаются прежде всего тем, что ПЦР и детекция ее результатов осуществляются одновременно в одной закрытой пробирке. Это не только технологически упрощает методику проведения анализа, но и предотвращает контаминацию лабораторных помещений и исследуемых образцов продуктами предшествующих ПЦР.
При ПЦР в реальном времени детекция результатов происходит за счет флюоресценции, возникающей при гибридизации флюорогенного ДНК-зонда с амплифицируемым в ходе ПЦР специфическим фрагментом ДНК. Структура флюорогенных ДНК-зондов построена таким образом, что флюоресцентный маркер высвобождается в результате ферментативной реакции или дистанцируется от молекулы гасителя флюоресценции только при специфической гибридизации с искомой молекулой ДНК, амплифицируемой в ходе ПЦР. При росте числа гибридизированных с зондом молекул возрастание флюоресценции до детектируемого уровня пропорционально числу молекул амплифицированного продукта. Поскольку при каждом цикле ПЦР количество молекул фрагмента ДНК умножается вдвое, номер цикла, с которого флюоресценция определяется и возрастает, обратно пропорционален числу молекул ДНК в исходном образце. Если в реакцию ввести в качестве калибратора несколько различных известных концентраций молекул соответствующего фрагмента ДНК микобактерий туберкулеза, то с помощью компьютерной программы может быть рассчитано и количество геномов ДНК в исследуемом материале. На рис. 13-8 и рис. 13-9 представлены примеры количественной ПЦР в реальном времени.
Каждый стандартный образец дублирован. Количественный критерий - минимальное число циклов ПЦР, необходимое для начала и роста определяемой флюоресценции. По оси абсцисс - количество циклов; по оси ординат - величина флюоресценции. Концентрации ДНК обратно пропорциональны числу циклов, необходимых для появления флюоресценции. В окнах правой колонки (21-32) отмечены номера циклов для соответствующих концентраций. Различия между 10-кратными концентрациями фрагментов ДНК 100-1000000 мл - 3.2-3.4 цикла. Для двух пациентов концентрации фрагментов IS6110 составили около 1000/мл и 10000/мл. С учетом числа повторов (6-20) анализируемых фрагментов в геноме микобактерий туберкулеза число микобактерий в клинических образцах - около 100 и 1000 клеток соответственно.
Смотрите также:
