Разделение ДНК и РНК центрифугированием
Высокоэффективным методом разделения нуклеиновых кислот, широко используемым при их очистке, является центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия . В этом случае высокая ионная сила буферного раствора в центрифужных пробирках способствует диссоциации комплексов белков и нуклеиновых кислот, и разделение макромолекул происходит на основании их различий в плавучей плотности. Перемещение макромолекул во время центрифугирования происходит до тех пор, пока они не достигнут зоны раствора CsCl с плотностью, равной их плавучей плотности. В этой зоне происходит их концентрирование. Метод центрифугирования в градиенте плотности CsCI в присутствии бромистого этидия используется в генной инженерии для получения векторных плазмид в препаративных количествах. Он позволяет отделять суперскрученные молекулы ДНК от релаксированных и линейных, так как их плавучие плотности заметно различаются из-за разного количества молекул бромистого этидия, интеркалированного в эти топологические изомеры плазмидной ДНК. В практической генной инженерии для очистки векторных плазмид центрифугирование в градиенте плотности CsCI используется редко. В целях обычного применения рекомбинантных ДНК, в том числе для молекулярного клонирования, построения рестрикционных карт и определения последовательности нуклеотидов (секвенирования), разработаны методы минипрепаративного выделения. В одном из них суперскрученные молекулы рекомбинантных плазмидных ДНК легко отделяются от линейных молекул хромосомной и плазмидной ДНК в процессе щелочной денатурации с последующей быстрой нейтрализацией раствора. При этом в основном успевают ренатурировать только суперскрученные молекулы ДНК, так как две их цепи остаются физически связанными друг с другом в процессе денатурации. Образовавшийся комплекс денатурированной ДНК и белков отделяется от плазмидной ДНК центрифугированием, а от основной массы РНК освобождаются переосаждением в присутствии высокой концентрации LiCl.
Широко распространенным методом фракционирования нуклеиновых кислот по размерам молекул является центрифугирование в градиенте концентрации глицерина.
Смотрите также:
