Ретикулоциты
Ретикулоциты - непосредственные предшественники эритроцитов .
В отличие от эритроцитов, в которых при световой микроскопии не выявляются внутриклеточные структуры, в ретикулоцитах обнаружены гранулярные и нитевидные образования. Ретикулоциты выявляются как в костном мозге , так и в периферической крови . В норме они составляют 5 - 10% от общего числа эритроцитов, при ускорении эритропоэза доля ретикулоцитов возрастает, а при замедлении - снижается. В случае усиленного разрушения эритроцитов доля ретикулоцитов может превышать 50%. При резко ускоренном эритропоэзе в крови могут появляться даже нормобласты (предшественники ретикулоцитов).
Полную информацию о строении гена может дать определение его первичной структуры, т.е. последовательности составляющих ген нуклеотидов. При исследовании протяженных (до 40 т.п.о.) клонированных последовательностей нуклеотидов, включающих исследуемые гены, строят их рестрикционные карты . Рестрикционные карты представляют собой схемы, изображающие взаимное расположение сайтов рестрикции для разных рестриктаз и расстояния между ними. Поскольку каждый сайт рестрикции является не чем иным, как строго определенной последовательностью нуклеотидов ДНК, рестрикционные карты заключают в себе информацию об особенностях первичной структуры картируемых участков генома.
Для построения рестрикционной карты используют гибридизацию по методу Е. Саузерна. Клонированный фрагмент ДНК отдельно или в составе вектора получают в препаративном количестве, затем его обрабатывают соответствующими рестриктазами и продукты рестрикции разделяют электрофорезом в агарозном геле. Количество образовавшихся рестрикционных фрагментов ДНК, обнаруживаемых после окрашивания бромистым этидием в виде флуоресцирующих полос в ультрафиолетовом свете, соответствует количеству сайтов рестрикции в том случае, если различия в размерах образовавшихся фрагментов ДНК достаточны для их разделения при электрофорезе.
Размеры рестрикционных фрагментов оценивают путем сравнения их электрофоретической подвижности с таковой фрагментов ДНК известных размеров. Получив информацию о количестве сайтов рестрикции в гене, далее определяют их взаимное расположение. Для этого в качестве зондов выбирают короткие фрагменты ДНК и после введения в них радиоактивной метки гибридизуют с рестрикционными фрагментами ДНК, которые после электрофоретического разделения в агарозном геле были перенесены на нитроцеллюлозные или нейлоновые фильтры. По завершении гибридизации положение фрагментов ДНК, связавших метку, на фильтрах обнаруживают с помощью авторадиографии. Получение такой информации о принадлежности конкретных фрагментов ДНК, образовавшихся под действием различных рестриктаз, к 5'- или 3'-концевым частям исследуемой последовательности нуклеотидов обычно бывает достаточным для определения взаимного расположения различных сайтов рестрикции на рестрикционных картах.
Смотрите также:
