ИЛ-2 рекомбинантный (rИЛ-2): продукция эукариотическими системами
Одной из наиболее удобных и продуктивных эукариотических систем для синтеза и секреции гетерологичных белков являются дрожжи . В норме лишь очень немногие из дрожжевых белков секретируются в среду, и при достаточно высоком уровне гетерологичной экспрессии очистка необходимого продукта не составляет большого труда.
Для экспрессии IL-2 быка в дрожжах использовали плазмиду, которая содержала кодирующую зрелый белок последовательность кДНК IL-2 быка, промотор алкогольдегидрогеназы и лидерную последовательность фактора дрожжей [ Price,V., ea, 1987 ]. Трансформированные такой плазмидой дрожжи секретировали в среду около 60 мг/л IL-2 с активностью 45 000 ед. на мкг белка, что вполне достаточно для коммерческого использования.
Как показал анализ очищенного белка, N-концевая последовательность секретируемого rIL-2 полностью соответствует зрелому белку, т.е. IL-2 правильно процессируется во время секреции. Молекулярный вес rIL-2 был равен 16 кДа, что приблизительно соответствует весу негликозилированной формы IL-2 (15,5 кДа), т.е. продуцируемый дрожжами IL-2 быка скорее всего не гликозилируется.
Высокий уровень продукции IL-2 был достигнут в клетках насекомых, с помощью бакуловирусного экспрессирующего вектора [ Smith,G.E., G.Ju, ea, 1985 ]. Клетки, инфицированные рекомбинантным вирусом, продуцировали около 10 ед. IL-2 на 1 мл культуры, что сравнимо с результатами, полученными для бактериальных систем. К сожалению, как показали экспериментальные данные, и в этой системе IL-2 не гликозилировался.
Чтобы получить IL-2, практически идентичный природному, необходимо использовать клеточную систему, обеспечивающую все необходимые посттрансляционные модификации. Такими системами являются клеточные линии млекопитающих.
К основным проблемам гетерологичной экспрессии белков в клетках млекопитающих относятся проблемы генетической стабильности получаемых трансформантов и уровень самой экспрессии, который зачастую оказывается гораздо ниже, чем в бактериях, дрожжах и клетках насекомых.
В случае IL-2 эти проблемы достаточно успешно были решены двумя группами исследователей [ Karasuyama H., ea, 1988 , Onomichi K., ea, 1987 ]. Onomichi K. с соавторами экспрессировали кДНК IL-2 в клетках китайского хомячка (СНО), дефектных по гену дигидрофолатредуктазы ( DGFH ) [ Onomichi K., ea, 1987 ].
Рекомбинантная плазмида содержала ген дигидрофолатредуктазы, кДНК IL-2 человека под контролем раннего промотора вируса SV40, участки сплайсинга и сигнал полиаденилирования этого вируса. Трансформированные клеточные линии содержали от 200 до 1600 копий данной плазмиды и конститутивно секретировали до 2мг/л IL-2 (или 95000 ед/мл). Полученные линии стабильно продуцировали IL-2 в течение месяца даже в отсутствии селективного агента.
Селекционная процедура является довольно сложной и трудоемкой. С этой точки зрения предпочтительной является система, предложенная Karasuyama H. и Melchers F. [ Karasuyama H., ea, 1988 ]. Авторы использовали вектор на основе бычьей паппиломы, содержащий фрагмент 69Т вирусной последовательности, металлотионеиновый промотор и сигнал полиаденилирования гена тимидинкиназы . После включения в состав вектора кДНК IL-2 мыши полученной плазмидой трансфицировали несколько клеточных линий ( фибробласты NIH3T3 , клетки опухоли молочной железы С127 и клетки миеломы Х63Ag8-653). Трансфицированные клетки стабильно несли в качестве экстрахромосомальных элементов 30-100 копий рекомбинантных плазмид и секретировали только около 200 ед/мл IL-2. Добавление ионов тяжелых металлов в культуральную среду увеличивало продукцию IL-2 в 2-6 раз. Удаление 3'-нетранслируемой области кДНК IL-2, содержащей АТ-богатую последовательность, приводило к повышению уровня секреции IL-2 на два порядка. После включения в состав плазмиды последовательности второго интрона гена бета-глобина кролика (для увеличения эффективности сплайсинга) продукция IL-2 возростала в 2 раза. В результате лучшие клеточные линии стабильно секретировали до 10 ед. IL-2 на 10 клеток за один день и сохраняли этот уровень продукции в течение 4 месяцев.
Для экспрессии IL-2 использовали также векторы на основе ретровирусов [ Yamada,G., Y.Kitamura, ea, 1987 , Bubenic,J, ea, 1988 ]. Однако, при трансфекции полученных конструкций в клетки L929 и RAT-1 был получен сравнительно невысокий уровень экспрессии IL-2 (от 200 до 3000 ед/мл).
Достаточно подробно были исследованы процессы гликозилирования rIL-2, протекающие в клеточных линиях СНО , Ltk- , BHK (клетки почек новорожденного хомячка) [ Conradt, ea, 1989 ]. Было установлено, что во всех исследованных образцах IL-2 олигосахариды связаны с белком через О-связь Thr3, и их структура аналогична структуре олигосахаридных цепей природного IL-2. Соотношение гликозилированной и негликозилированной форм rIL-2 не зависело от продуктивности клеточных линий или условий культивирования и определялось только типом клеток. Клетки СНО секретировали преимущественно гликозилированную форму IL-2, в то время как L-клетки продуцировали и гликозилированную, и негликозилированную формы rIL-2 в том же соотношении, что и периферические лимфоциты крови. Таким образом, рекомбинантный IL-2, полученный в клетках млекопитающих, гликозилировался аналогично природному IL-2.
Хромосомный ген IL-2 , в отличие от кДНК, использовался для экспрессии в гетерологичной системе гораздо реже. Это связано как с большими размерами хромосомного гена (7кв) и увеличивающейся поэтому сложностью работы, так и с наличием в гене IL-2 плохо исследованных регуляторных областей.
В работе [ Conradt, ea, 1986 ] клетки Ltk трансфицировали плазмидой, содержащей хромосомный ген IL-2 c 5'-фланкирующей областью. При этом IL-2 экспрессировался на очень низком, сравнимом с фоновым, уровне (около 4 ед/мл). Удаление 5'-фланкирующей области и включение в состав вектора раннего промотора SV-40 приводило к повышению продукции IL-2 до 1500 ед/мл [ Buhler Th.A., ea, 1990 ].
Хорошие результаты были получены при использовании амплифицирующегося вектора, содержащего ген IL-2 под своим собственным промотором и ген DHFR [ Onomichi K., ea, 1987 ]. Трансфицированные этой плазмидой клетки DHFR CHO, содержали до 1600 копий гена IL-2 и продуцировали около 7200 ед/мл IL -2 в день.
Перспективной системой для экспрессии чужеродных белков являются трансгенные животные . Трансгенная технология была использована для экспрессии хромосомного гена IL-2 под промотором казеина в молоке кроликов [ Sanger F., ea, 1977 ]. Авторами было получено 4 трансгенных кролика, молоко которых содержало биологически активный IL-2 в концентрации 50-400 нг/мл.
Смотрите также:
