Трансгенные животные: получение инъекцией ДНК в пронуклеус
Исторически более ранним и широко применяемым способом получения трансгенных животных является микроинъекция чужеродной ДНК в пронуклеус - ядро оплодотворенной яйцеклетки. Существуют детальные описания этого метода [ Аллен Н. и др., 1990 ; Hogan В. et al., 1986 ]. Суть метода состоит в том, что под контролем микроскопа при помощи микроманипулятора в мужской пронуклеус оплодотворенной яйцеклетки тонкой иглой (до 1 мкм) вводят около 2 пл раствора ДНК. Чужеродная ДНК, вначале свободно лежащая в нуклеоплазме, в течение нескольких последующих делений дробления случайным образом интегрирует в один из сайтов какой-либо хромосомы, т. е. встраивается в ДНК-реципиента. При этом, как показали эксперименты с меченой ДНК, в различных бластомерах одного и того же дробящегося зародыша интеграция может происходить в разные хромосомные сайты, и число интегрированных копий ДНК в каждом из этих сайтов может значительно варьировать. Тем не менее, поскольку эмбрион развивается из одного бластомера, во всех клетках такой особи после рождения чужеродная ДНК обычно находится только в одном каком-нибудь хромосомном сайте, хотя у разных особей она интегрируется по-разному и в разные сайты.
После введения чужеродной ДНК в пронуклеус яйцеклетку трансплантируют самке-реципиенту. Доля трансгенных животньк в потомстве таких самок варьирует от 10 до 30%. Это означает, что подобный механический вариант трансфекции чужеродных генов на ранней стадии эмбриогенеза является чрезвычайно эффективным.
Идентификацию трансгенных животных производят путем анализа геномной ДНК на наличие экзогенных последовательностей, используя при этом методы блот-гибридизации или ПЦР . Экспрессию введенного гена анализируют путем идентификации специфических мРНК и/или соответствующих белковых продуктов в различных тканях трансгенного животного.
Смотрите также:
