Блоттинг по Саузерну
Блоттингом (буквально - промакивание) называют перенос фрагментов макромолекул (ДНК, РНК или белка), разделенных с помощью электрофореза в геле, на твердую подложку - мембрану. В исследованиях генома человека часто используют метод блоттинга, разработанный Саузерном, при котором олигонуклеотидный зонд, находящийся в растворе, гибридизуется с ДНК, адсорбированной на мембране. Геномную ДНК (обычно выделенную из лейкоцитов или клеток плода) расщепляют на короткие фрагменты, разделяют их в агарозном геле, переносят на мембрану, после чего идентифицируют специфические участки с помощью гибридизации с олигонуклеотидными зондами ( рис. 65.6 ). Этим методом выявляют уникальные фрагменты ДНК, размер которых составляет приблизительно одну миллионную часть генома.
Значимость метода для медицины обусловлена возможностью исследовать определенный фрагмент геномной ДНК у любого человека.
Метод используют для выявления крупных перестроек в ДНК и некоторых точечных мутаций (большинство точечных мутаций этим методом выявить нельзя).
Денатурация ДНК осуществляется с помощью щелочи. После окончания электрофореза гель помещают в растворор основания (щелочи), в котором двухчепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.
-Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр производиться в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на его поверхности. После переноса одночепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле. 3. Для того чтобы визуально выявить нужные фрагменты (фиксированная на фильтре ДНК не видна), проводят гибридизацию со специфическим по нуклеотидной последовательности меченным радионуклидам или флюоресцентной меткой олигонуклеотидным синтетическим зондом (такой зонд состоит из 16-30 пар осваний), или клонированным фрагментом ДНК. Нуклеотидная последовательность зонда должна быть полностью или частично комплементарна изучаемому участку геномной ДНК.
При инкубации фильтра с раствором, содержащим меченый зонд, происходит гибридизация комплементарных цепей ДНК зонда и фрагмента на фильтре. Неспецифические связанные молекулы зонда отмываются с помощью специальной процедуры.
Радиоактивно меченные участки выявляют путем экспонирования фильтра с рентгеновской пленкой (ауторадиография). После проявления на пленке видны полосы меченной зондом ДНК.
Нерадиоактивные метки визуализируют с помощью флюоресценции или опосредованно с помощью антител.
Смотрите также:
