OLA (oligonucleotide ligation assay)
OLA (oligonucleotide ligation assay) - методы детекции состояния гена, основанные на дотировании синтетических олигонуклеотидных зондов.
При проведении этих реакций специфические ДНК- или РНК- последовательности исследуют путем использования их в качестве матрицы для ковалентного связывания двух пар олигонуклеотидных зондов [ Landegren U.N., 1993 ]. ДНК-зонды для лигирования подбирают таким образом, чтобы они были полностью комплементарны нормальному фрагменту ДНК в области локализации мутации, причем сама нуклеотидная замена должна находиться на стыке двух праймеров. Обычно в один из зондов вводят радиоактивную или флюоресцентную метку, а другой метят биотином.
После гибридизации при строго стандартных условиях синтезированные олигонуклеотидные последовательности сшивают ДНК- лигазами из термофильных микроорганизмов. Такие ферменты работают при высоких температурах и сохраняют свою активность в условиях, необходимых для проведения денатурации молекул ДНК. При наличии мутации в тестируемой молекуле ДНК на конце одного из зондов образуется сайт некомплементарного спаривания, непосредственно примыкающий к месту лигирования. Наличие терминального неспаренного основания в смежно расположенных последовательностях ДНК-зондов резко снижает скорость лигирования, и при определенных условиях проведения реакции сшивки между зондами в этом случае не происходит.
Метод включает несколько последовательных циклов гибридизации, лигирования и денатурации. Начиная со второго цикла, матричной ДНК для гибридизации зондов наряду с тестируемой пробой служат также дотированные последовательности. В дальнейшем проводят электрофоретический анализ меченых однонитевых фрагментов ДНК. Система успешно апробирована на мутациях глобиновых генов при серповидно-клеточной анемии и на мутации delF508 при муковисцидозе .
Смотрите также:
