Лямбдоидные бактериофаги
Встраивание фага лямбда в хромосому E.coli и его выщепление опосредуется белковым комплексом, содержащим интегразу фага. Этот комплекс осуществляет рекомбинацию по специфическим последова- тельностям ДНК, названным сайтами первичного присоединения (primary attachment sites).Возможны также незаконные рекомбинации с другими последовательностями ДНК, что приводит к встраиванию фага в сайты вторичного узнавания или делециям фаговых и хромо- сомных последовательностей.
Встраивание и выщепление фага лямбда были широко изучены in vivo и in vitro [ 208 ]. Встраивание требует два белка и два сайта. Белок интеграза (Int) кодируется фаговым геном int, хозяй- ский фактор интеграции (integration host factor IHF) кодируется хозяйскими генами hinA и hinD. Один из сайтов, attP, является 240-н.п. фаговой последовательностью; другой, attB, - это бакте- риальная последовательность длиной 23 н.п.. Выщепление требует те же два белка, а также Xis-белок, кодируемый фагом, Fis-белок, кодируемый хозяином, (фактор для стимуляции инверсий ) и два сайта, фланкирующие встроенный профаг, attL и attR.
Первичные сайты att имеют общую последовательность длиной 15 н.п., называемую "core", обычно обозначаемую буквой O, и отличаю- тся последовательностями, фланкирующими core. Последовательности attP справа и слева от core обозначаются P и P', соответственно, а в attB - B и B'. Центральный нуклеотид core обозначается как ноль, P длится до -150, P' до +90, а B и B' до -11 и +11 соответ- ственно. Последовательность attB следующая:
-7 * 0 +7
*************** v *** *** ************* attB G*C C T G C T T*T T*T*T A T*A*C T*A A C T T G* top
T*G G A C G A A*A A*A*A T A*T*G A*T T G A A C* bottom
*************** *** *** ^ *************
* * *
*********** core ************ (сайты связывания интегразы обведены, стрелки обозначают сайты разрезания). Реакции встраивания и выщепления могут быть представлены следующим образом:
встраивание
************> POP' (attP) + BOB' (attB) POB' (attL) + BOP' (attR)
<************ ="70 ]), которая формируется бел- ками, взаимодействующими с att. Имеется 11 белок-связывающих сай- тов в attP, 7 для Int (2 в P, 2 в O и 3 в P'), 3 для IHF (2 в P, 1 в P'), 2 для Xis и 1 для Fis (все в P). attB содер- жит только два связывающих сайта, оба для Int. Int-связывающие сайты бывают двух типов: arm и core. Int, присоединенный к arm-последовательности AGTCACTAT сгибает ДНК (IHF и Xis играют ту же роль), а Int, прикрепленный к core-последовательности CAACTTNNT расщепляет и воссоединяет ДНК, опосредуя этим обмен нитями.
Все сайты P и P' частей attP должны быть неповрежденными для эффективного рекомбинационного встраивания (attP * attB), в то время как 60 н.п., содержащие два Int-, один IHF-, и один Xis- связывающий сайты, могут быть вырезаны из P-части без влияния на эффективность рекомбинационного выщепления (attL * attR)[ 36 ]. Так же, мутация в P'-части воздействует на рекомбинационное встраива- ние более сильно, чем на рекомбинационное выщепление.
Обмен нитями инициируется разрезанием верхней нити между нук- леотидами -2 и -3 [ 211 ].Это генерирует свободные 5'- и 3'- концы, с которыми Int остается ковалентно связаным. Энергия разрезаной фосфодиэфирной связи сохраняется и используется для присоединения связаной с ферментом ДНК к 5'-нуклеотиду. В норме, этот нуклеотид получен в результате Int-катализируемого разрезания другого att- сайта. Присоединение приводит к обмену верхних нитей рекомбиниру- ющих att-сайтов и генерирует промежуточный продукт Holliday типа, который разрушается после разрезания нижних нитей между нуклеоти- дами +4 и +5 и их обмена. Так как обмен верхних нитей уже прошел в позиции левого разреза (-2/-3), а нижних - правого (+4/+5), то получившаяся рекомбинантная молекула содержит материал от обеих предков в 7-н.п. районе, ограниченном сайтами разреза (называю- щемся районом перекрывания).
Int-опосредованная рекомбинация между последовательностями, отличными от первичных att-сайтов может считаться незаконной. Степень гомологии между рекомбинирующими сайтами влияют на эффек- тивность данного процесса. Фаг с мутантным attP-сайтом, названный attP-safG (site affinity, gal) был изолирован встраиванием с по- следующим выщеплением во вторичный attP сайт в гене gal. Пере- крывающиеся последовательности attP и gal attB различаются по трем позициям (+1,+2 и +4). Встраивание фага лямбда дикого типа и его последующее выщепление из gal гена приводит к замене 7-нукле- отидного перекрывающегося района attP на gal attB. Затем эта последовательность была перенесена в attB-сайт путем другого цик- ла встраивания-выщепления, использующего attP-safG фага, который производит мутантный attB-safG сайт . Гомологичные сайты прикрепления (attP * attB; attP-safG * attB-safG) рекомбинируют в 100-1000 раз более эффективно, чем негомологичные, давая до 80% лизогенных клеток.
Тем же методом были получены другие saf-мутанты вторичных сайтов прикрепления из генов: trpC(safT), malG(safM) и leu (safL) [61]. safT, отличающийся от сайта дикого типа по одной позиции (C->A в +4), рекомбинирует в 4-20 раз эффективнее в гомологичном, чем в гетерологичном перекресте с att дикого типа.
Использование мутированных in vitro att-сайтов подтверждает необходимость гомологии района перекрывания [ 18 ]. Два таких сай- та несут мутацию внутри этого района (T->A или T->G в позиции -2), а два - вне (T->A или T->G в позиции -3). Мутанты по позиции -3 эффективно рекомбинировали in vivo, тогда как у мутантов по пози- ции -2 эффективность рекомбинации была в 1000 раз меньше [18]. Эксперименты с гетеродуплексными attB сайтами, полученными путем #
Смотрите также:
