Плазмида pC194
Множество одноцепочечных ДНК- плазмид , которые реплицируются аналогично одноцепочечным ДНК фагам E.coli, были обнаружены в G+ бактериях [ 100 , 101 ]. Было показано, что очищеный репликационный белок одной из них, pT181, (i) рассекает начало репликации плазмиды, (ii) рассекает одноцепоченую ДНК в последо- вательностях, похожих на nick-сайт репликатора, и (iii) in vitro производит запечатывание надреза в репликаторе [ 148a , 149 , 150 ]. Репликационный белок другой плазмиды,pC194,опосредует незаконную рекомбинацию in vivo.
Гибриды , составленые из фага f1 (одноцепоченоый ДНК фаг, родственный M13 ) и плазмидами pBR322 и pC194 стабильны в B.subtilis, но не в E.coli). Когда их структура была такова, что делеции , оканчивающиеся в начале репликации фага f1 (раздел " Бактериофаг М13 "),не могли дать рост жизнеспособным плазмидам в E.coli, может быть изучено менее частое вовлечение репликацион- ного белка pC194 в формирование делеций (известно, что pC194 реплицируется в E.coli) [ 56 , 100 ]. Стабильные плазмиды формировались в E.coli в результате делеций, которые в большинстве случаях имели один конец в одном сайте внутри начала репликации pC194. Инактивация репликационного белка плазмиды отменяла формирование делеций в этом сайте . Было предположено, что сайт, в котором оканчивались делеции, и есть nick-сайт pC194 . Другой делеционный конец варьировал.
Консенсус ,составленый на основе анализа 16 различных делеци- онных концов, YTTTM^AT, напоминал последовательность, фланкирую- щую nick-сайт pC194, CTTTG^AT. Это указывает на то, что реплика- ционный белок pC194 может генерировать делеции путем правильной инициации и, затем, аберрантной терминации синтеза ДНК.Поддержка данной гипотезы вытекает из анализа плазмиды, в которой надрезы должны быть сделаны в одной нити начала репликации f1 и pC194. В хозяине rep+, который разрешает рост репликационной вилки фага, делеции, начинающиеся в разрезе в pC194, оканчиваются в 1.5-kb районе, лежащем в 3'-направлении от репликатора f1. В хозяине мутантного rep, где репликационная вилка фага не может продви- гаться, делеции кончаются только в 0.2-kb районе от репликатора f1, по обе стороны. Это позволяет предположить, что одноцепочеч- ная ДНК репликационной вилки фага в rep-хозяине была использована как субстрат для анормальной терминации репликаци- онным белком pC19.
Правильная инициация и анормальная терминация репликации ДНК rep-белком pC194 может генерировать делеции,которые оканчиваются на нуклеотиде сразу за сайтом разрезания.Анормальная инициация и правильная терминация синтеза ДНК генерирует делеции,заканчиваю- щиеся на нуклеотиде сразу перед сайтом разрезания. Такие делеции наблюдались как у E.coli, так и у Streptococcus pneumoniae [ 17 ], в гибридных плазмидах, отличных от описаных выше. Различные концевые точки этих делеций совпадали с установленым консенсусом. Это значит, что белок A может использовать широкий набор сигналов как для инициации, так и для терминации, и выполнять весь процесс незаконной рекомбинации. Напротив, репли- кационный белок M13, по-видимому, использует гораздо более узкий набор субстратов и, следовательно, только запускает незаконную рекомбинацию путем надрезания начала репликации, но не завершает ее.
Смотрите также:
