ПЦР: общие сведения
Полимеразная цепная реакция, ПЦР (polymerase chain reaction, PCR, греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие) - ферментативная реакция, осуществляемая in vitro с помощью термостабильной ДНК-полимеразы на матрице ДНК с использованием олигонуклеотидных ДНК-затравок (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям противоположных цепей ДНК на границах амплифицируемого участка. ПЦР представляет собой серию из 3-х циклически повторяющихся реакций (обычно в сумме осуществляют 20-30 циклов): денатурация ДНК, отжиг ДНК-затравок с матрицей и синтез ДНК с помощью ДНК-полимеразы с каждой из затравок навстречу друг другу с использованием противоположных цепей ДНК в качестве матриц. По завершении каждого цикла количество синтезированного продукта удваивается и происходит увеличение количества анализируемой ДНК в геометрической прогрессии, что позволяет в миллионы раз увеличивать количество изучаемого фрагмента ДНК в пробе. ПЦР используется для клонирования и секвенирования ДНК, при картировании генов, в генной инженерии и медицинской ПЦР-диагностике. Предложена К. Мюллисом в 1985 г. (Нобелевская премия за 1993 г.).
ПЦР позволяет найти в исследуемом клиническом материале небольшой участок генетической информации (несколько десятков пар нуклеотидов ДНК или РНК) любого организма, содержащийся в следовых количествах среди огромного количества нуклеотидных последовательностей иной природы, и быстро размножить его. По сути дела метод ПЦР имитирует в пробирке естественную репликацию ДНК, только повторяющуюся с огромной скоростью и столько раз, сколько это необходимо исследователю.
Метод включает несколько этапов: расплетание двойной спирали ДНК, расхождение нитей ДНК и последующее комплементарное дополнение (достройку) обеих с помощью специального фермента. Репликация ДНК может начаться не в любой точке, а только в определенных стартовых блоках - коротких двунитевых участках.
Для проведения такого процесса используют две генетические пробы (праймеры), которые служат в качестве затравки для синтеза второй цепи на однонитевой ДНК. Праймеры - это искусственно синтезированные короткие нуклеотидные последовательности (15-30 нуклеотидов), комплементарные концам размножаемых (амплифицируемых) участков нитей ДНК. Понятно, что, чтобы иметь нужные праймеры, необходимо знать нуклеотидную последовательность того участка ДНК, который требуется размножить. Суть метода ПЦР отображена на рис. 28.
Сначала двунитевую ДНК нагревают до температуры около 100 град. С. При этом комплементарные нити ДНК расходятся между собой (ДНК денатурирует). Затем к обеим нитям ДНК по принципу комплементарности присоединяют искусственно синтезированные праймеры, в результате чего образуются короткие двунитевые "стартовые" участки. Далее в действие вступает специфический бактериальный фермент - Taq-полимераза, устойчивая к высоким температурам, при которых другие белки теряют свои свойства. Термоустойчивая полимераза осуществляет in vitro синтез вторых цепей ДНК на каждой из двух денатурированных цепей. После нового прогрева до 100град.С уже вновь синтезированные фрагменты ДНК служат в качестве матрицы для синтеза новых нитей в следующем цикле амплификации - это и есть цепная реакция ПЦР.
В результате такого "тиражирования" за 2-3 часа количество копий фрагмента ДНК увеличивается в геометрической прогрессии, и через 25 циклов амплификации синтезируется 106 копий фрагмента. Такого количества ДНК достаточно, чтобы визуально регистрировать с помощью простых приемов, которые давно используются молекулярными биологами.
Метод амплификации ДНК с помощью ПЦР (полимеразной цепной реакции) оказал революционное влияние на генодиагностику. Для использования метода необходимо знать последовательность нуклеотидов на исследуемом участке ДНК.
Поскольку ДНК-полимераза не способна сама начать репликацию и может только достраивать комплементарную цепь к уже имеющемуся двухцепочечному участку, то сначала синтезируют два олигонуклеотида (так называемых праймера), комплементарных участкам противоположных цепей ДНК, обычно отстоящих друг от друга на несколько сотен пар нуклеотидов (рис. 65.7 ). Праймеры инкубируют с ДНК, намеченной для амплификации, и ДНК-полимеразой, которая, как известно, синтезирует комплементарные цепи в направлении 5'-3'. Специфичность реакции зависит от правильного выбора праймеров.
В ходе реакции последовательно меняют температуру: при температуре 90-95 градусов по С происходит разделение цепей ДНК, при температуре 40-60 градусов по С - присоединение праймера (отжиг), при температуре 72 градуса по С - синтез цепей ДНК.
В реакции используют термостойкую ДНК-полимеразу, которая не теряет активности в течение всей процедуры.
После ряда таких циклов, обычно 20-30 и более, образуются сотни тысяч копий исходной последовательности, расположенной между праймерами. Метод настолько чувствителен, что его можно использовать, например, для амплификации и анализа единственного участка ДНК из одного сперматозоида человека.
Для ПЦР пригоден минимально обработанный исходный биологический материал, даже частично разрушенный, что позволяет исследовать цельную кровь, пятна высохшей крови, смывы из ротовой полости, старые срезы ткани и другие образцы. Исходным материалом для ПЦР служит геномная ДНК или мРНК. В последнем случае из мРНК путем обратной транскрипции получают кДНК , которую затем используют в ПЦР, - так называемый метод ПЦР с обратной транскрипцией .
Метод ПЦР служит основой для дальнейших исследований амплифицированной последовательности:
- расщепления рестриктазами;
- гибридизации с аллель-специфическими олигонуклеотидными зондами;
- определения нуклеотидной последовательности;
- исследования экспрессии in vitro с целью поиска мутаций, укорачивающих молекулу белка.
Различные модификации метода применяются для:
- синтеза одноцепочечной ДНК путем изменения соотношения олигонуклеотидных праймеров;
- создания рекомбинантных ДНК;
- исследования мутагенеза клонированной ДНК;
- сравнения экспрессии разных аллелей;
- выявления редких нуклеотидных последовательностей или ДНК возбудителей инфекции.
ПЦР можно провести всего за один день, ее легко автоматизировать, реакция сравнительно недорога и чрезвычайно специфична.
Принцип ПЦР заключается в чередовании циклов гибридизации одноцепочечных ДНК или РНК с мечеными олигонуклеотидными зондами (праймерами), синтеза комплементарной нуклеотидной последовательности с помощью термостабильной ДНК-полимеразы и денатурации образовавшихся двухцепочечных структур путем нагревания. За 20-30 циклов количество копий нужного фрагмента нуклеиновой кислоты достигает нескольких миллионов.
Для определения продукта реакции, как правило, используют хемилюминесценцию.
Хотя при некоторых заболеваниях большая часть мутаций возникает в результате крупных делеций ДНК , которые выявляются с помощью саузерн-блоттинга , большинство аномалий генов, лежащих в основе многих заболеваний, представляют собой точечные мутации . После обнаружения точечной мутации можно синтезировать конструкции ДНК (праймеры), покрывающие короткий участок, пораженный мутацией. Получение достаточного количества копий измененной ДНК может быть сложно, но ПЦР предоставляет множественные копии специфических фрагментов ДНК. При ПЦР амплификация ДНК осуществляется путем повторных тепловых циклов. ПЦР произвела революцию в диагностике мутаций. Это высокочувствительный, стандартизированный и автоматический метод, который можно проводить на малом количестве образцов. Метод относительно недорог и в течение нескольких часов можно получить миллиарды копий специфических нуклеотидных последовательностей ДНК ( рис. 28.4 ).
Смотрите также:
