ФКУ, генотерапия
Группа американских ученых под руководством Woo S. (Бэйло- ровский медицинский коледж, Хьюстон, США) еще в 1985 году про- вела первые работы по встраиванию кДНК фенилаланингидроксилазы человека (клон phPAH 247) в эукариотический вектор, содержащий промотор и кеп сайт гена металлотионина человека (MTll) ( Ledley F.D.,1985b ). Проведение анализа клеток мыши линии NIH 3T3, трансформированных рекомбинантным клоном MPAH(+), с помощью Southern, Nothern, Western блот-гибридизаций выявило стабильную интеграцию и экспрессию гена фенилаланингидроксилазы человека в клетках мыши. В клеточном экстракте трансформированных клеток была зарегистрировала птеринзавиcимая активность фенилаланингид- роксилазы.
В последующих своих работах авторы использовали для перено- са гена ФАГ в качестве векторов ретровирусы.
3' нетранслируемая область кДНК, включая сигнал полиадени- лиpoвания, была делетирована с помощью рестриктазы Hind lll. Об- ласть кДНК, соответствующая 1-1899 парам оснований, была субкло- нирована в Bam Hl сайт ретровирусного вектора p ZIP-NEO SV (X), содержащий бактериальный "neo" ген. Данный дефектный ретровирус лишен генов gag, pol и env и следовательно не может осуществлять вирусную пролиферацию. Однако, он сохраняет способность инфициро- вать широкий круг клеток и стабильно интегрировать провирусную ДНК в клеточный геном. Полученный авторами рекомбинантный ретро- вирус pZPAH (+) содержал ген ФАГ человека, фланкированный с обеих сторон 5' и 3' длинными концевыми повторами (LTR), а также участок нуклеотидной последовательности (E) для упаковки в капсид и ген neo ( Ledley F.D.,1986 ).
Для наработки гибридных ретровирусов использовали комплемен- тирующую линию клеток 2. Данная линия клеток содержит мутантную провирусную ДНК вируса лейкемии мышей Moloney (Mo-MLV) с делетиро- ванным участком нуклеотидной последовательности, необходимым для упаковки вирусной РНК в капсид. В результате этого ДНК Mo-MLV не инфекционна, однако в трансформированных клетках она направляет синтез белковых продуктов генов gag, pol и env, которые она со- держит. Вводимая в такие клетки дефектная гибридная провирусная ДНК дает начало вирусному потомству, содержащему чужеродные гены.
Линию клеток 2 трансформировали кальций-фосфатным мето- дом гибридным вектором pZPAH(+) для получения ретровирусов, несу- щих ген фенилаланингидроксилазы человека. Стабильные трансформан- ты, содержащие интегрированную ДНК с селективным маркером "neo" скринировали на среде с антибиотиком геноцитином (G-418). В ре- зультате этих экспериментов было показано образование в клетках
2 гибридных ретровирусов, способных эффективно трансдуцировать ген ФАГ человека. Супернатантом этих клеток инфицировали клетки фибробластов мыши линии NIH 3T3 и клетки гепатомы мыши hepa 1-a (HPRT-). Рекомбинатные клоны клеток линии NIH 3T3 выяв- ляли на среде с антибиотитком G-418, а клетки hepa-1a на среде с 6-тиогуанином.
С помощью Southern и Nothern блот-гибридизаций в геноме трансформированных клеток была выявлена стабильная интеграция и эффективная транскрипция гена ФАГ человека. Данные иммуноблоттинга со спефической в отношении ФАГ антисывороткой выявили наличие им- мунореактивного протеина - ФАГ. В клетках NIH 3T3, трансформиро- ванных pZPAH(+), была зарегистрирована птерин-зависимая актив- ность ФАГ, которая достигала 15 - 75% от активности ФАГ в клет- ках гепатомы человека линии hep G-2. Клеточные экстракты клеток гепатомы мыши hepa-1a, трансформированные pZPAH(+), обладали фер- ментативной активностью ФАГ, зарегистрированной in situ по спо- собности перевода [14С] фенилаланина в [14С] тирозин.
В следующей работе авторы использовали рекомбинантный рет- ровирус, содержащий кДНК ФАГ человека под контролем промотора ге- на альфа-1 антитрипсина человека ( Peng H.,1988 ). Данный промотор обладает высокой тканеспецифической экспрессией в клетках печени.
При создании рекомбинантного ретровируса авторы первоначаль- но использовали фрагмент Smal-EcoRl кДНК phPAH247, содержащий 213- 2453 пары оснований, клонировали в Hind lll сайт вектора pA10 CAT2. Данный вектор содержит TATA бокс и инициирующий сайт раннего промо- тора вируса SV 40, а также промотор гена альфа-1 - антитрипсина че- ловека, т.е. Ava l - Bam Hl фрагмент из 700 пар оснований. Данный фрагмент гена альфа-1 - антитрипсина в цисположении придает генам высокую тканеспецифическую экспрессию в клетках печени. Затем фрагмент размером 2 килобазы, содержащий гибридный промотор а1 AT/SV40 и кДНК ФАГ, был вырезан рестриктазой Sal l - Hpa l и встроен в Xho l сайт ретровируса N2. Ретровирус N2 содержит длин- ные концевые повторы (LTR) вируса лейкемии мышей Moloney, учас- ток Е, необходимый для упаковки в капсид, включая 5'конец gag об- ласти, а также Tn5 неомицин резистентный ген. Созданный рекомби- нантный ретровирус авторы обозначали pNAS-hPAH.
В данной работе авторы исследовали транскрипцию мРНК гена ФАГ человека в клетках фибробластов мыши линии PA317 и первичной культуре гепатоцитов мыши. Результаты Northern гибридизации показа- ли, что в клетках фибробастов мыши происходит транскрипция полно- размерной провирусной мРНК с длинных концевых повторов (LTR). Не- большое количество мРНК транскрибируется с внутреннего химерного промотора а1 AT/SV40. В гепатоцитах высокий уровень транскрип- ции происходил как с LTR, так и с внутреннего гибридного промотора а1 AT/SV40. Уровень экспрессии гена ФАГ человека в последнем случае сравним с конституитивным синтезом мРНК в клетках печени человека.
Проведенная экспериментальная работа явилась важным шагом на пути к генной заместительной терапии. Можно полагать, что кро- ме диетотерапии возможен альтернативный путь лечения фенилкетону- рии путем генотерапии. Получение у больных фенилкетонурией клеток печени путем пункции с последующим инфицированием клеток рекомби- нантными ретровирусами, содержащими полноценный ген ФАГ, и реин- плантацией гепатоцитов будет способствовать устранению дефекта фенилаланингидроксилазной активности клеток печени.
В последние пять лет в центре исследовательских работ по генной терапии находится направление работ по созданию прямых сис- тем по доставке ДНК в нужные ткани органов (например, печени), ос- нованные на использовании ДНК-протеиновых комплексов. Для повыше- ния эффективности переноса этих комплексов стали использовать аде- новирусы с дефектной системой репликации, осуществляющие эндосо- мальный лизис. Были проведены модельные работы по соматической ге- нотерапии фенилкетонурии на мышах, основанные на комбинации этих методов ( Fang B.,1993 ; Cristiano R.J.,1993 ). Исследовательские работы были выполнены как на гепатоцитах мыши линии PAH- in vitro ( Cristiano R.J.,1993 ), так и in vivo на мышах линии Pahenu2, ими- тирующих больных фенилкетонурией ( Fang B.,1993 ). У подопытных мы- шей через 5 дней полностью восстанавливалась активность фенилала- нингидроксилазы и нормализовался уровень фенилаланина в сыворотке крови в результате проникновения и экспресии чужеродной ДНК в гепа- тоцитах мыши ( Fang B.,1993 ).
На данный метод по корректировке генетических болезней об- мена веществ, в частности фенилкетонурии, возлагаются большие на- дежды, т.к. данный метод не требует хирургических вмешательств.
Смотрите также:
