Ядерный матрикс: экстракция 2М раствором NaCl
На первый взгляд решение вопроса о том, занимают ли основания петель ДНК специфические позиции в геноме, представляется достаточно простым. Как уже говорилось, экстракция изолированных ядер 2 М раствором NaCl позволяет получить нерастворимые в данных условиях остаточные ядерные структуры (так называемый ядерный матрикс ), содержащие всю ядерную ДНК, организованную в закрепленные на матриксе петли. Умеренная обработка таких препаратов теми илп иными нуклеазами с последующим осаждением быстроседиментирующих структур позволяет разделить ДНК на две фракции. Дистальные части петель ДНК, отрезанные от ядерного матрикса, остаются в супернатанте, тогда как фрагменты ДНК, содержащие участки прикрепления к матриксу, находятся в осадке вместе с быстроседпментирующими остаточными ядерными структурами. Варьируя интенсивность нуклеазной обработки, можно получать фракции прилежащей к ядерному матриксу ДНК различного размера. Следуя логике процедуры фракционирования, можно полагать, что каждый фрагмент ДНК, выделяемый в составе комплекса ДНК с ядерным матриксом, должен включать участок прикрепления к матриксу и окружающие его последовательности ДНК. В целом ряде экспериментов полученные таким образом препараты прилежащей к ядерному матриксу ДНК были использованы в качестве зондов для гибридизации с клонированными фрагментами геномной ДНК. Результаты такого рода опытов оказались весьма неожиданными. Было продемонстрировано, что к ядерному матриксу прикрепляются транскрибирующиеся и потенциально активные в данном типе клеток последовательности [ Cook ea 1980 , Cook ea 1982 , Robinson ea 1982 , Robinson ea 1983 , Small ea 1985 , Ciejek ea 1982 , JostJ.-P., ea 1984 , Mirell ea 1982 , Razin ea 1985 ]. Характер взаимодействия ДНК с ядерным матриксом различался в клетках одного и того же организма, дифференцированных по разным путям [ Ciejek ea 1982 , JostJ.-P., ea 1984 , Razin ea 1985 ]. Эти результаты были восприняты достаточно скептически. Было высказано предположение о том, что выявляемое прикрепление активных генов к ядерному матриксу является артефактом, возникающим в процессе экстракции ядер концентрированным солевым раствором. Предполагалось, что процедура экстракции может вызывать преципитацию транскрипционных комплексов либо их копреципитацию вместе с молекулами новосинтезированной РНК [ Mirkovich ea 1984 , Kirov ea 1984 , Roberge ea 1988 ]. Это последнее предположение было, однако, опровергнуто с помощью ряда специальных контрольных экспериментов. Было, в частности, показано, что обработка ядер РНКазой, проводимая до или после экстракции концентрированным солевым раствором, не приводит к диссоциации активных генов от ядерного матрикса [ Cook ea 1978 , Vogelstein ea 1985 ].
Активные гены остаются прикрепленными к ядерному матриксу и при временной остановке транскрипции в клетках, подвергнутых тепловому шоку, либо в ядрах, обработанных специфическими ингибиторами РНК-полимераз [ Small ea 1985 , Яровая ea 1985 ].
При изучении кластеров генов (таких, например, как кластер альбуминовых генов кур) не было выявлено корреляции между уровнем транскрипции разных генов и степенью их представленности в препаратах прилежащей к ядерному матриксу ДНК [ Ciejek ea 1983 ].
Понятно, что такая корреляция должна иметь место, если транскрибируемые последовательности оказываются в составе ядерного матрикса в результате преципитации транскрипционных комплексов. Наконец, было показано, что в ходе принудительной дифференцировки клеток под действием гормонов ассоциация с ядерным матриксом генов, экспресогрующихся в дифференцированных клетках, предшествует началу их транскрипции [ JostJ.-P., ea 1984 ].
Все эти результаты показывают, что прикрепление активных генов к ядерному матриксу не является прямым следствием их транскрипции. Хотя результаты перечисленных выше опытов и их интерпретация представляются нам весьма убедительными, возможность артефактной преципитации активных генов в xoде обработки ядер концентрированным солевым раствором продолжали обсуждать и в последующие годы.
Это побудило Кука и соавт. [ Jackson ea 1988 ] разработать альтернативную процедуру выделения прикрепленной к ядерному матриксу ДНК. Они предложили удалять из ядер отрезанные нуклеазами дистальные части петель ДНК посредством их электроэлюции в растворе с физиологическзми значениями ионной силы. Используя данную процедуру фракционирования, авторы подтвердили все основные заключения, сделанные ранее в экспериментах с солевой экстракцией ядер. Подводя итог, можно сказать, что изучение прикрепленной к ядерному матриксу ДНК показало, что взаимодействие ДНК со скелетными элементами хромосомы происходит не случайным образом. В то же время, полученные результаты едва ли можно было интерпретировать в рамках простой модели, основанной на допущении того, что все фрагменты прикрепленной к ядерному матриксу ДНК являются основаниями петель, о которых говорилось в предыдущем разделе.
Надо сказать, что в опытах, обсуждение которых выходит за рамки обзора, было показано, что не только транскрибирующиеся, но и реплицирующиеся [ Berzney R., ea 1975 , Van der Velden ea 1984 , Dijkwel ea 1979 , Pardoll ea 1980 ], а возможно, и репарирующиеся [ McCready ea 1984 , Razin ea 1986 ] последовательности ДНК прикрепляются к ядерному матриксу. Трудно предположить, что все эти фрагменты являются основаниями топологических доменов (закрепленных на ядерном матриксе/хромосомном остове петель ДНК), размеры которых одинаковы в интерфазных зщрах и метафазных хромосомах и, следовательно, не зависят ни от транскрипционного, ни от репликативного статуса отдельных генов, равно как и генома в целом.
В этой связи рядом автором было выдвинуто предположение о том, что основания топологических доменов составляют лишь некую часть от общего числа участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу. С целью проверки данного предположения мы проанализировали характер взаимодействия с ядерным матриксом различных областей домена а-глобиновых генов кур в эритробластах (где глобиновые гены активно транскрибируются) и зрелых эритроцитах, ядра которых функционально неактивны [ Farache ea 1990 ].
Полученные результаты оказались достаточно любопытными. В зрелых эритроцитах к ядерному матриксу были прикреплены последовательности ДНК, фланкирующие домен с 5'- и З'-концов, тогда как в составе ядерного матрикса эритробластов помимо этих последовательностей были обнаружены транскрибируемые участки (собственно гены). Логично было предположить, что участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу, сохраняющиеся в неактивных ядрах, являются основаниями топологических петель ДНК. Мы назвали их перманентными участками прикрепления ДНК к ядерному матриксу . В опытах по коренатурации препаратов прикрепленной к ядерному матриксу ДНК из эритробластов и зрелых эритроцитов кур было показано, что перманентные участки прикрепления составляют около 30% от общего числа экспериментально выявляемых участков прикрепления ДНК к матриксу [ Razin ea 1986 ].
После исчерпывающей нуклеазной обработки интерфазных ядер и последующей их экстракции концентрированным солевым раствором в составе ядерного матрикса остаются короткие фрагменты ДНК, размеры которых колеблются от 50 до 150 п.н. Можно полагать, что эти фрагменты защищены от нуклеазной атаки посредством взаимодействия с белками ядерного матрикса. Иными словами, они вовлечены в организацию участков прикрепления ДНК к ядерному матриксу. Мы клонировали такие короткие фрагменты ДНК, выделенные из ядерного матрикса зрелых эритроцитов кур (т.е. происходящие из перманентных участков прикрепления ДНК к матриксу), и проанализировали нуклеотидные последовательности ряда таких фрагментов ( рис. 1 ) [ Каландадзе ea 1988 ].
Хотя никакого консенсуса выявлено не было, проанализированные последовательности имели ряд общих черт, выражающихся в наличии блоков пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, несовершенных палиндромов и несовершенных коротких повторов (так называемых простых последовательностей). Аналогичные наблюдения были сделаны и другими авторами при анализе последовательностей коротких фрагментов прикрепленной к ядерному матриксу ДНК, выделенных из клеток, синхронизированных на границе Gl/S-фаз.
Смотрите также:
