ДНК участок: Детерминанты сайтов сплайсинга
Сравнение последовательностей и эксперименты по мутагенезу идентифицируют элементы РНК, необходимые для нормального процесса сплайсинга . Консервативные последовательности c/aAG|GURAGU или G|GUAUGU соответственно у млекопитающих и дрожжей обнаруживаются у 5'-сайтов сплайсинга , и последовательность Py11NYAG| у 3'-сайтов сплайсинга млекопитающих ( Teem, 1984 , Ruskin, 1985 ). Выбор 5' сайтов сплайсинга зависит от его соответствия с консервативной последовательностью, последовательностей окружающих его и от расстояния от 3' сайта сплайсинга ( Lear, 1990 , Nelson and Green 1990 ). Концевой G интрона может взаимодействовать посредством не-Утсон-Криковского спаривания для сведения 5' и 3' экзонов вместе ( Parker, 1993 ).
Последовательность брэнч сайта UACUAAC в дрожжах и YNCUGAC у млекопитающих (где предпоследний A формирует 2'-5' связь) обычно находится на расстоянии от 17 до 40 нуклеотидов слева от 3' сайта сплайсинга ( Keller, 1984 , Konarska 1985 , Nelson, 1989 ). Это согласуется с наблюдением, что дополнительный ложный сайт активизируется на расстоянии от 22 до 37 нуклеотидов при мутациях нормального сайта ( Reed 1988 ). В противоположность этому брэнч сайт расположенный на расстоянии 177 нуклеотидов эффективно используется в ряде альтернативно-сплайсируемых РНК ( Helfman 1989 , Smith 1989 ). Было предположено, что выбор брэнч сайта определяется его связью с полипиримидиновым трактом и его точным соответствием контексту, но не близостью от AG 3' сайта сплайсинга . Также они предпологают, что выбор 3' сайта сплайсинга определяется как первый AG после брэнч сайта - полипиримидинового сайта. Этот AG должен находиться в предпочтительном контексте: т.е. находиться на расстоянии по краеней мере в 12 нуклеотидов от 3' конца брэнч сайта и не принадлежать структурной шпильке ( Smith 1993 ). В дальнейших экспериментах было показано, что брэнч сайты активируются в пре-мРНК содержащих длинный полипиримидиновый тракт за этим сайтом и что брэнч сайт, за которым следует короткий полипиримидиновый тракт требуют дополнительного динуклеотида AG.
Для полного прохождения всех реакций сплайсинга его аппарат ( сплайсома ) должен распознавать на пре-мРНК три критические последовательности нуклеотидов: 3'- и 5'-концевые сайты сплайсинга и точку разветвления. В соответствии с моделью поиска экзонов в пре-мРНК с большими интронами, аппарат сплайсинга отыскивает два близкорасположенных сайта сплайсинга в нужной ориентации.
Распознавание конкретной пары сайтов сплайсинга в пре-мРНК дрожжей начинается с взаимодействия по принципу комплементарности между последовательностями этих сайтов и 5'-концевыми участками мяРНК U1, входящих в состав U1-мяРНП-частиц в случае 5'-концевых сайтов сплайсинга, а также белка U2AF65 , находящегося в комплексе с U2AF35 , с последовательностью 3'-концевого сайта сплайсинга.
Эффективность функционирования сайтов сплайсинга зависит от степени соответствия их первичной структуры консенсусным последовательностям. Сближение двух сайтов сплайсинга, сопровождаемое выпетливанием последовательности интрона, осуществляется с участием SR-белков , обогащенных Ser и Arg, которые взаимодействуют с 70К-белком (70 кДа), входящим в состав U1-мяРНП-частицы, а также U2AF35 на другом конце интрона. Такие комплексы, образованные с участием SR-белков, получили название " коммитированных комплексов ". В то время как 5'-концевые сайты сплайсинга довольно консервативны, 3'-концевые сайты обнаруживают большую вариабельность. U1-мяРНП, находящиеся в комплексе с 5'- концевым сайтом сплайсинга, стимулируют присоединение белков U2AF к 3'-концевому сайту и способствуют правильному распознаванию соответствующего экзона в процессе, получившем название " определение экзона ". Эффективное распознавание сайтов сплайсинга соответствующими белками является критическим этапом в правильном и упорядоченном удалении экзонов из пре-мРНК в процессе конститутивного сплайсинга.
