Количественная ПЦР
Количественная ПЦР (quantitative PCR, qPCR,) - количественная ПЦР в режиме реального времени (real-time polymerase chain reaction, quаntitative polymerase chain reaction, qPCR).
Количественная ПЦР (греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие) - вариант ПЦР, при котором непрерывно регистрируется кинетика реакции, что позволяет количественно оценивать содержание определенных нуклеотидных последовательностей ДНК в сложной смеси молекул.
Первый вариант этого метода был предложен П. Холландом с соавт. в 1991 г. (метод «TaqMan»). Согласно протоколу в реакционную смесь кроме обычных двух праймеров добавляют олигонуклеотидный зонд, меченный по 5'-концу флуорофором и содержащий в своей центральной или 3'-части глушитель флуоресценции, который отжигается в каждом цикле реакции с центральным участком ампликона(2) между двумя амплифицирующими его праймерами. Сам зонд не используется в качестве праймера, поскольку 3'-концевая гидроксильная группа блокирована ортофосфатом. В ходе реакции термостабильная Taq-полимераза вытесняет зонд из дуплекса, а затем за счет своей 5'-3'-экзонуклеазной активности отщепляет его 5'-концевой нуклеотид, меченный флуорофором. Чем выше концентрация амплифицируемой нуклеотидной последовательности в реакционной смеси, тем меньше требуется количество циклов для того, чтобы интенсивность флуоресценции освободившегося флуорофора в пробе превысила базальный уровень свободного зонда с глушителем. С этого момента (порог числа циклов) появляется возможность наблюдать за кинетикой реального накопления флуорофора в реакционной смеси.
С помощью методов количественной ПЦР обнаруживают качественные изменения в генах: точковые мутации, делеции и вставки. Однако при некоторых наследственных заболеваниях соответствующие симптомы возникают в ответ на изменение дозы определенных генов.
Типичным примером наследственного заболевания, обусловленного изменением числа копий участка хромосомы 21 в геноме человека, является синдром Дауна . Цитогенетически это заболевание может быть диагностировано по трисомии хромосомы 21 или по наличию крупных транслокаций части этой хромосомы на другие, на фоне присутствия двух нормальных хромосом 21. Описаны клинические случаи синдрома Дауна, при которых не происходит видимых изменений кариотипа. Это обусловлено дупликацией небольшого участка хромосомы 21. Выявление таких мутаций невозможно традиционными цитогенетическими методами. Однако с помощью количественной ПЦР определение полуторакратного возрастания дозы соответствующего участка хромосомы 21 становится совершенно реальным.
Проведение количественной ПЦР характеризуется двумя особенностями. Во-первых, ПЦР проводят в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов или праймеров, меченных с помощью радиоактивной или флуоресцентной метки, с тем чтобы точно определять количество образовавшегося продукта ПЦР. Во-вторых, во время ПЦР необходимо завершать реакцию достаточно рано, пока не образовалось слишком много ПЦР-продуктов. Это связано с тем, что в конечной фазе насыщения, когда продуктов ПЦР становится слишком много, лимитирующими звеньями реакции становятся как субстраты (дезоксирибонуклеозидтрифосфаты), так и сам фермент, для молекул которого становится слишком много матричной ДНК в виде ПЦР- продуктов. В таких условиях завершение очередного цикла ПЦР уже не сопровождается удвоением количества ПЦР-продуктов и происходит нивелирование небольших количественных различий между разными пробами, которые достаточно четко выявляются на ранних стадиях ПЦР после прохождения нескольких циклов реакции.
Оригинальный метод идентификации делеций , находящихся в гетерозиготном состоянии или локализованных в аутосомных генах, основан на использовании в качестве матричной ДНК для ПЦР кДНК, полученной путем обратной транскрипции из эктопической мРНК или из мРНК, изолированной из экспрессирующих данный ген тканей или культур клеток пациента. В отличие от нормального гомолога, в мутантной молекуле кДНК граничащие с делецией экзоны сближены. Если в качестве олигопраймеров для ПЦР будут выбраны последовательности из этих областей гена, только мутантная кДНК будет служить матрицей для амплификации небольшого участка между праймерами из фланкирующих делецию экзонов. В нормальной последовательности кДНК этот участок может быть слишком велик для того, чтобы прошла амплификация. Практически для обнаружения гетерозигот по протяженным внутригенным делениям проводят мультиплексную ПЦР с использованием системы олигопраймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов, полностью перекрывающих всю молекулу кДНК. Наличие делеций регистрируют по появлению продуктов амплификации необычного размера.
См. также Обратная транскрипция — полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Смотрите также:
