Гнездовая ПЦР
Гнездовая полимеразная цепная реакция, гнездовая ПЦР (nested polymerase chain reaction, nested PCR, греч. polymeres — состоящий из многих частей, многообразный; лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия, и actio — действие) - вариант ПЦР с использованием двух пар праймеров (внешних и внутренних), одна из которых способна амплифицировать внутренний участок ампликона, полученного после первого раунда амплификации с внешней парой праймеров. Существует несколько вариантов применения гнездовой ПЦР в лабораторной диагностике. Напр., в одном из вариантов проводится амплификация (15—30 циклов) с внешней парой праймеров, при этом амплифицируется основной фрагмент ДНК. Далее часть содержимого переносится в новую пробирку, содержащую реакционную смесь, в состав которой входит пара праймеров, узнающая последовательности, лежащие внутри основного ампликона. Второй раунд амплификации (реамплификации) также составляет 15-30 циклов. В другом варианте температура отжига внутренней пары праймеров подбирается с таким расчетом, чтобы при проведении первого раунда амплификации они не участвовали в реакции. Обычно температура отжига праймеров в этом варианте гнездовой ПЦР подбирается на 10-15°С ниже, чем для внешней пары праймеров; программа амплификации в этом случае состоит из двух программных блоков. После проведения первого программного блока амплификации температура отжига праймеров для второго раунда задается на 10 градусов ниже, что обеспечивает эффективное участие внутренней пары праймеров во втором раунде амплификации. По сравнению со стандартной полимеразной цепной реакцией гнездовая ПЦР имеет более высокую чувствительность и специфичность.
Гнездовая ПЦР используется для детекции ДНК в следовых количествах (1-100 копий на пробу). Поскольку праймеры для гнездовой ПЦР подбираются таким образом, чтобы места гибридизации праймеров для второй ПЦР находились внутри участка ДНК, ограниченного праймерами для первой ПЦР, специфический продукт первой ПЦР может служить матрицей во второй ПЦР, а неспецифические продукты, если они образуются в течение первой реакции, выступать в роли матрицы во второй ПЦР не могут. Гнездовая ПЦР требует для выполнения анализа несколько большего времени, но позволяет добиться повышения чувствительности и специфичности анализа.
Смотрите также:
