Компоненты реакционной смеси ПЦР
Компоненты реакционной смеси, которые обязательно должны быть добавлены в пробирку:
1) термостабильная ДНК-полимераза ;
2) два олигонуклеотидных праймера (обычно длиной 20 н.о.), подобранные на специфический участок ДНК, который необходимо копировать;
3) четыре дезоксирибонуклеотида (dNTPs) ;
4) ДНК или РНК, выделенные из клинического образца;
5) набор солей определенной кислотности (буферная система), в котором ДНК-полимераза эффективно работает; обязательно содержит ионы Mg2+.
Состав реакционной смеси необходимо подбирать в каждом конкретном случае. Ионный состав и рН реакционного буфера необходимо подбирать так, чтобы активность термостабильной ДНК-полимеразы, используемой в реакции, была максимальной. Значение рН для различных термостабильных ДНК-полимераз должно находиться в интервале 8,2-8,9, значение ионной силы - 0,01-0,08. Обычно используют 0,04-0,25 мМ концентрацию каждого dNTP. Увеличение концентрации dNTP до 1,0-1,2 мМ снижает активность фермента на 30%. Концентрация ионов Mg2+ оказывает существенное влияние на активность термостабильных ДНК-полимераз. Наличие в ДНК-матрице примесей хелатирующих агентов может привести к снижению концентрации свободных ионов Mg2+ и, тем самым, к снижению эффективности ПЦР. При суммарной концентрации dNTPs 0,7-0,8 мМ, оптимальная концентрация этого иона 1,5-2,0 мМ, повышение концентрации ионов Mg2+ до 10 мМ снижает активность Taq ДНК-полимеразы на 50%.
Необходимо отметить, что при проведении реакции обратной транскрипции можно использовать в качестве двухвалентного иона как Mg2+, так и Мn2+. Обычно применяемая концентрация праймеров 0,3-1,0 мкМ. Высокая концентрация праймеров может приводить к образованию праймерных димеров. Для стабилизации фермента некоторые исследователи рекомендуют использовать 10% диметилсульфоксид (DMSO) . Однако высокие концентрации DMSO (более 10%) могут снижать активность Taq ДНК-полимеразы почти на 50%. Для повышения эффективности гибридизации ДНК (РНК) и праймера можно использовать тетраметиламмонийхлорид , при этом ингибирования ДНК- полимеразы не наблюдается.
Смотрите также:
