Реакция биологической нейтрализации: общие сведения
Реакция нейтрализации (РН) основана на способности специфических антител вступать во взаимодействие с антигенными детерминантами белков оболочки вириона и нейтрализовать инфекционную активность вируса. РН является одной из наиболее специфических серологических реакций, используемых в вирусологии.
В РН участвуют такие компоненты, как вирус, сыворотки или ИАЖ (испытуемые или заведомо положительные, содержащие вируснейтрализующие антитела) и чувствительная биологическая модель (лабораторные животные или культуры клеток).
Вирус. Перед постановкой РН готовят активную вируссодержащую субстанцию, представляющую собой супернатант, полученный после центрифугирования исходной вируссодержащей суспензии (из мозга и органов инфицированных лабораторных животных или из клеточных культур) при 1500-2000 об./мин в течение 30 мин на холоду. Такой материал без снижения инфекционной активности можно хранить в течение длительного времени при температуре -70*С.
Сыворотка крови. С диагностической целью в РН исследуют парные стерильные сыворотки больных, взятые в первые дни заболевания и в период реконвалесценции. Оптимальные сроки заболевания зависят от динамики образования вируснейтрализующих антител, характерной для той или иной инфекции. Например, при клещевом энцефалите максимальное накопление вируснейтрализующих антител происходит через 7-8 нед, а при ЛХМ - через 2-3 мес. Для выявления сероконверсии (4-кратный или более значительный прирост специфических антител) парные сыворотки следует титровать одномоментно. Для инактивации содержащихся в сыворотках и ИАЖ комплемента и неспецифических ингибиторов их прогревают на водяной бане в течение 20 мин при температуре 56-60*С. Приготовленные таким образом сыворотки можно хранить 3 нед при температуре 4*С, а более длительное время - при -20 или -70*С. В РН необходимо использовать заведомо положительные и заведомо отрицательные контрольные сыворотки или ИАЖ.
Тест-системы. В качестве тест-системы для постановки РН с вирусами наиболее часто используют новорожденных белых мышей, чувствительных к репликации многих вирусов, или белых мышей массой 6-7 г.
При постановке РН в культурах клеток обычно используют такие чувствительные виды культур, в которых вирус вызывает выраженный цитопатический эффект или формирует бляшки под агаровым покрытием. Для разведения вируса и сывороток в этом случае применяют питательную среду, которая является поддерживающей для данного вида клеток.
Постановка опыта нейтрализации. В зависимости от варианта постановки РН позволяет определять титры антител в сыворотках или индексы нейтрализации сывороток. Влияние неспецифических ингибиторов при постановке РН сказывается только при использовании неразведенных сывороток или их низких разведений (1:2, 1:4, 1:8).
Определение титра антител против постоянной дозы вируса. Для расчета рабочего разведения вируса следует предварительно оттитровать вируссодержащий материал на животных или в культурах клеток, используя 10-кратные разведения вируса. Предельные разведения вируса, вызывающие гибель 50% животных или 50%-ный цитопатический эффект в лунках с культурами клетками, считают одной инфекционной дозой. В РН обычно используют 100 ЛД(50), 100 ТЦД(50) или 100 БОЕ (если РН основана на феномене редукции числа бляшек).
Последовательные двукратные разведения (обычно начиная с разведения 1:4, 1:5 или 1:10) инактивированных сывороток или ИАЖ в равных объемах соединяют со стандартной дозой вируса; смеси встряхивают, выдерживают 1-1,5 ч при температуре 37*С или 18-24 ч при 4*С и используют для заражения животных (по 4 особи на каждое разведение материала) или, по крайней мере, по 2-4 лунки с клеточными культурами.
При постановке РН в культурах клеток из лунок 24-, 48- или 96- луночных пластиковых культуральных панелей или из культуральных флаконов с выращенным монослоем клеток тщательно удаляют питательную среду, после чего монослой заражают смесью одной дозы вируса с разведенными сыворотками в соотношении 1:1 в объеме, достаточном, чтобы покрыть тонким слоем монослой клеток. После адсорбции вируса с клетками при температуре 37*С в течение 30-45 мин в лунки вносят поддерживающую культуральную среду, содержащую 1-2% сыворотки эмбриона телят или КРС (проверенной предварительно на отсутствие специфических антител) и антибиотики.
При постановке РН по методу редукции числа бляшек рекомендуется приготовить следующий возможный состав агарового покрытия: на 100 мл покрытия непосредственно перед опытом готовят два состава ингредиентов. В первый состав входят: 19 мл трижды дистиллированной воды, 10 мл бесцветного 10-кратного раствора Эрла, 3,5 мл 7% раствора бикарбоната натрия, 7,5 мл сыворотки телят или сыворотки КРС, 2 мл красителя (нейтрального красного), приготовленного на трижды дистиллированной воде в разведении 1:1000, и 1 мл куриного эмбрионального экстракта (если в качестве монослоя были использованы фиброобласти 9-дневных куриных эмбрионов).
Второй состав покрытия готовят таким образом: 1,25 г агара (фирма "Дифко", США) вносят в колбу с 50 мл трижды дистиллированной воды. Колбу помещают на водяную баню и кипятят в течение примерно 20 мин до полного расплавления агара. Затем агар снимают с бани и в колбу добавляют 5 мл 0,5% раствора протаминсульфата в дистиллированной воде. После этого, помешивая флакон с первым составом, туда осторожно вливают расплавленный агар. Полученную смесь интенсивно перемешивают, охлаждают до температуры 40*С и по 8 мл вносят в 25 куб.см флаконы с монослоем инфицированных клеток, избегая при этом образования пузырей в покрытии. Флаконы с покрытием оставляют при комнатной температуре на 30 мин до затвердения агара, после чего инкубируют при 37*С.
Контроль. При постановке РН на белых мышах или культурах клеток с постоянной дозой вируса ставят следующие контроли: контроль испытуемых сывороток или ИАЖ на токсичность (для клеточных культур) в первом из используемых разведений (1:4, 1:5 или 1:10); контроль рабочей дозы вируса без сыворотки и в смеси с нормальной неиммунной сывороткой; контроль специфической нейтрализации вируса гомологичной иммунной сывороткой или ИАЖ и контроль интактных (незараженных) животных или культур клеток.
Смотрите также:
