Рекомбинанты и реассортанты определенного генетического состава
Нередко скрещивание вирусов применяется не для генетического картирования или характеристики генома, а для получения рекомбинантов или реассортантов определенного генетического состава. В этих случаях селективные условия используются не для регистрации частоты рекомбинаций или реассортаций, как при генетическом картировании, а для отбора гибридных вирусов, имеющих заданный генотип. В качестве примера можно привести скрещивание вирусов гриппа с целью получить штаммы для продукции инактивированных или живых вакцин.
Иммунный ответ, предотвращающий заболевание, направлен против двух поверхностных гликопротеидов вируса гриппа , гемагглютинина и нейраминидазы . Антитела против гемагглютинина нейтрализуют инфекционность вируса, а антитела против нейраминидазы ограничивают его распространение от клетки к клетке. У вирусов гриппа человека гемагглютинин и нейраминидаза быстро эволюционируют. Этот процесс, называемый антигенным дрейфом , делает необходимым постоянное обновление вакцинных штаммов вируса. Штамм для инактивированной вакцины должен содержать гены гемагглютина и нейраминидазы современного варианта вируса, а остальные геномные сегменты должны обеспечить вирусу высокий уровень репродукции, необходимый для производства больших количеств вакцины. Штамм для живой вакцины должен быть аттенуированным , т.е. вызывать у человека бессимптомную инфекцию. Поэтому в состав таких штаммов кроме генов гемагглютинина и нейраминидазы современного вируса должны входить гены аттенуированного варианта вируса гриппа (донора аттенуации).
Классическим методом получения штаммов для инактивированных и живых вакцин является скрещивание. В обоих случаях проводят совместное заражение клеток современным штаммом, выделенным при недавней вспышке заболевания, и штаммом, который является донором признака высокопродуктивности (для инактивированных вакцин) или донором аттенуации (для живых вакцин). Задача получения реассортантов для живой вакцины облегчается тем, что в качестве донора аттенуации используют холодо-адаптированный штамм, который хорошо размножается при пониженной температуре, в отличие от эпидемического штамма. Поскольку смешанную инфекцию ведут при пониженной температуре, непермиссивной или полупермиссивной для эпидемического штамма, основная масса продуцируемого в таких условиях вируса получает большую часть генов от штамма-донора аттенуации.
При скрещивании эпидемического вируса с высокопродуктивным штаммом для получения штамма для инактивированной вакцины тоже большая часть генов попадает в вирусные частицы потомства от высокопродуктивного штамма, поскольку его геномные сегменты интенсивнее реплицируются, чем геномные сегменты эпидемического штамма. Вирусное потомство обрабатывают иммунной сывороткой против штамма-донора высокопродуктивности (или донора аттенуации) и затем пассируют в присутствии такой сыворотки, после чего в вирусном потомстве сохраняются только те вирусные частицы, которые имеют гемагглютинин и нейраминидазу эпидемического штамма, а большую часть остальных генов - от донора аттенуации или донора высокопродуктивности. Затем проводят клонирование методом бляшек или методом предельных разведений. Полученные клоны генотипируют и выбирают те, которые имеют желательный генетический состав, т.е. гены гемагглютинина и нейраминидазы эпидемического вируса, а остальные 6 генов - донора аттенуации или донора высокопродуктивности (реассортанты 6:2).
Аналогичным образом проводят реассортацию и в тех случаях, когда желательно получить реассортант определенного генного состава для какой-либо иной цели. В некоторых случаях один из вирусов-родителей подвергают УФ-облучению в такой дозе, которая инактивирует почти все геномные сегменты. Те немногие вирусные частицы, в которых один сегмент остался интактным, используются для смешанной инфекции. Вирусное потомство, естественно, будет представлено в основном тем вирусом-родителем, который не был подвергнут облучению, но некоторые вирусные частицы все же будут содержать по одному гену облученного вируса-родителя. Применив селективные условия, можно получить клоны таких одногенных реассортантов. Например, если реассортант должен содержать ген гемагглютинина облученного вируса-родителя, вирусное потомство обрабатывают антителами против гемагглютинина необлученного вируса-родителя, после чего проводят пассаж вируса и клонирование.
Успехи в развитии генно-инженерных методов сделали возможным получение рекомбинантов и реассортантов заданного генного состава без проведения скрещивания путем смешанного заражения и селекции. Тем не менее этот классический подход еще сохраняет определенное практическое значение. Для фундаментальных исследований, в особенности в области изучения механизмов рекомбинации и реассортации, это значение сохраняется в полной мере. Поскольку оба эти явления играют важнейшую роль в эволюции вирусов и, в частности, в появлении новых возбудителей опасных заболеваний, методы скрещивания и селекции вирусов не только имеют широкую сферу применения, но и продолжают разрабатываться и совершенствоваться.
Смотрите также:
.gif)