ПДРФ-анализ (RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism) метод
Наличие сайтов рестрикции в геномной ДНК и их взаимное расположение однозначно определяются последовательностью нуклеотидов исследуемой ДНК, поскольку сам сайт рестрикции - не что иное, как строго определенная последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая и расщепляемая рестриктазами. Следовательно, любая мутация, изменяющая последовательность нуклеотидов сайта рестрикции, уничтожает этот сайт. Полное расщепление анализируемой геномной ДНК отдельными рестриктазами приводит к образованию определенного набора фрагментов ДНК, число и размеры которых соответствуют расположению сайтов рестрикции. Гибридизация по Саузерну позволяет определять размеры и взаимное расположение рестрикционных фрагментов ДНК после их электрофоретического разделения.Мутационная изменчивость в сайтах рестрикции может быть легко обнаружена по изменению длины рестрикционных фрагментов ДНК, гибридизующихся со специфическими ДНК-зондами. При наличии мутации в одном из сайтов рестрикции этот сайт остается нерасщепленным после завершения рестрикции, что приводит к слиянию соседних рестрикционных фрагментов ДНК, разделяемых мутантным сайтом, и образованию фрагмента ДНК большего размера. В результате длина рестрикционных фрагментов ДНК, содержащих мутантные сайты, становится полиморфной, что выявляется при сравнении ДНК из разных источников методом ПДРФ.
Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, так называемый ПДРФ-анализ (Restriction Fragment Length Polymorphism - RFLP analysis) включает следующие этапы: выделение геномной ДНК, ее рестрикцию специфической эндонуклеазой, элекрофоретическое разделение образующихся фрагментов ДНК и идентификацию фрагментов ДНК, содержащих полиморфный сайт рестрикции, путем блот-гибридизации по Саузерну.
При отсутствии рестрикции в полиморфном сайте на электрофореграммах или радиоавтографах (в зависимости от типа мечения ДНК-зонда) будет выявляться один крупный фрагмент, соответствующий по длине последовательности ДНК между двумя соседними константными сайтами рестрикции для той же эндонуклеазы. При наличии рестрикции в полиморфном локусе на электрофореграмме будет присутствовать меньший по размерам фрагмент, равный расстоянию между полиморфным сайтом рестрикции и одним из ближайших константных сайтов рестрикции.
С каким именно из двух фрагментов, прилегающих к полиморфному локусу, будет происходить гибридизация, зависит от локализации используемого для анализа ДНК-зонда. В частном случае возможна гибридизация одновременно с двумя соседними рестрикционными фрагментами, если выбранный ДНК-зонд комплементарен последовательности, содержащей полиморфный сайт рестрикции. Однако такие зонды очень редко используются на практике, так как длина рестрикционных фрагментов обычно в десятки раз больше длины ДНК-зондов и далеко не всегда удается выделить и проклонировать фрагмент ДНК, содержащий полиморфный сайт рестрикции. Чаще всего при отсутствии рестрикции в полиморфном сайте ДНК-зонд гибридизуется с одним длинным фрагментом, а при наличии рестрикции гибридизующийся фрагмент имеет меньшую длину.
Таким образом, при анализе ДНК особей, в обеих хромосомах которых присутствует сайт рестрикции в полиморфной области, на электрофореграмме будет выявлен только один бэнд в нижней области геля, соответствующий более короткому фрагменту ДНК. У особей, гомозиготных по мутации, изменяющей полиморфный сайт рестрикции, будет наблюдаться один бэнд в верхней части геля, соответствующий фрагменту большей длины, тогда, как у гетерозигот проявятся оба эта бэнда.
ПДРФ-анализ может быть значительно упрощен в том случае, если возможна специфическая амплификация участка ДНК, содержащего полиморфный сайт рестрикции. Тестирование состояния этого локуса возможно путем проведения ПЦР и рестрикции амплифицированного фрагмента. При отсутсвии сайта узнавания в исследуемой области ДНК размеры амплифицированного фрагмента не изменятся после его обработки соответствующей эндонуклеазой, тогда как при полном соответствии полиморфной области сайгу pecтрикции образуются два фрагмента меньшей длины. У гетерозигот будут присутствовать 3 фрагмента, один из которых по длине будет соответствовать размеру амплификата до рестрикции, плюс 2 маленьких фрагмента с той же суммарной длиной. Таким образом, как и в случае использования для анализа блот-гибридизации по Саузерну, трем возможным вариантам генотипа будут соответствовать три различных варианта электрофореграмм.
Первичная идентификация полиморфных сайтов рестрикции, сцепленных с определенными генами, возможна только при наличии соответствующих ДНК-зондов. Дальнейшая тактика заключается в поиске рестрикционной нуклеазы, выявляющей полиморфизм. С этои целью используют широкий набор эндонуклеаз для рестрикции геномной ДНК, выделенной из группы неродственных индивидуумов. представляющих собой репрезентативную выборку популяции. Затем проводят ПДРФ-анализ отдельно для каждой из рестриктаз с набором имеющихся ДНК-зондов. После обнаружения полиморфизма в одной из популяций аналогичные исследования проводят в других популяциях.
Полиморфные сайты рестрикции всегда представляют собой двухаллельную систему, поэтому даже при самой высокой вариабельности такого caйтa число гетерозиготных по данному локусу особей в популяции не будет превышать 50%. Между тем только при наличии полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии можно отличить мутантный аллель от нормального, т. е. осуществить его молекулярную маркировку. Следовательно, информационная емкость такого полиморфизма относительно невелика.
Метод ПДРФ широко используется в генетических исследованиях популяций, поскольку наличие в геноме исследуемого организма рестрикционного фрагмента ДНК определенной длины является прекрасным генетическим маркером и одновременно фенотипическим признаком, тесно связанным с генотипом организма. Это позволяет следить за распространением такого маркера в популяциях, передачей его от родителей к потомству при скрещиваниях и использовать для построения генетических карт исследуемых организмов классические генетические методы. ПДРФ-маркеры благодаря их четкой принадлежности определенным генетическим локусам не уступают по информативности распространенным биохимическим маркерам и во многих случаях оказываются удобнее сложных фенотипических признаков (таких, как цвет глаз, окраска волос или шерсти, форма цветков и листьев), определяемых многими генными локусами.
Смотрите также:
