Анализ гетеродуплексов (HA) метод для поиска мутаций
НА (Heteroduplex analysis) - гетеродуплексный анализ позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде или в гетерозиготном состоянии. У подавляющего большинства пациентов с генными болезнями, наследуемыми по аутосомно-рецессивному типу, мутации в гомологичных хромосомах находятся в компаунде, т. е. в каждом из гомологичных генов имеются функционально значимые нарушения, но их молекулярная природа и внутригенная локализация различны. Исключение составляют лишь мажорные мутации , частота которых в популяции достигает десятков процентов. Примерами таких мутаций являются дельтаF508 в гене муковисцидоза или мутация R408W в гене фенилкетонурии .
Принцип НА-метода заключается в том, что при амплификации относительно небольших фрагментов генов гетерозигот или гомозиготных компаундов мутация может быть локализована лишь в одной из гомологичных нитей матричной ДНК. Поэтому в амплификационной смеси наряду с двумя типами гомодуплексов образуются гетеродуплексы между нормальной и мутантной цепочками ДНК. Наличие в двухцепочечном фрагменте ДНК неспаренных оснований изменяет конформацию такого гетеродуплекса, что проявляется в изменении электрофоретической подвижности фрагмента при проведении гель-электрофореза.
Гетеродуплексные молекулы ДНК имеют иную электрофоретическую подвижность по сравнению с гомодуплексами (не отличающимися между собой по подвижности) за счет конформационных особенностей в местах несовпадения нуклеотидов (mismatch) рис 4-6 . Эти различия могут быть обнаружены при электрофорезе в обычном полиакриламидном геле. Метод позволяет находить до 80% мутаций.
Значительно более эффективное разделение гомо- и гетеродуплексов может быть достигнуто при использовании новых вариантов гелей - Hydrolink либо MDE . Вероятность идентификации точечных мутаций этим способом на фрагментах ДНК менее 300 п.о. достигает 80-90%. Детекция мутаций осуществляется как изотопным, так и неизотопными методами [ Grompe М., 1993 ].
Смотрите также:
