SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism)
SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) - метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК, предложенный М. Орита с соавт. [ Orita M. et al., 1989 ; Glavac D., Dean М., 1993 ], основан на регистрации различий в электрофоретической подвижности однонитевых ДНК, одинаковых по величине, но различающихся вследствие нуклеотидных замен по пространственной организации молекул ( рис. 4.4 ). Скручивание, или конформация, небольших однонитевых ДНК существенно зависит от их нуклеотидной последовательности, так что замена даже одного основания в молекулах одинакового размера приводит к изменению их пространственной структуры.
Метод включает амплификацию специфических сегментов ДНК размером от 50 до 300 пар оснований, обычно в присутствии меченых dNTP, денатурацию образовавшихся продуктов ПЦР и нативный высокоразрешающий электрофорез в полиакриламидном геле.
Иногда амплификацию проводят без использования метки, но тогда для лучшего разделения ДНК и однозначной идентификации бэндов на электрофореграмме используют специальные гели - Hydrolink либо MDE (AT Biochem, USA ), а также более чувствительные по сравнению с бромидом этидия методы окрашивания, такие как окраска нитратом серебра . На процесс конформации оказывают влияние различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов [ Glavac D., Dean M., 1993 ]. Оптимальный подбор этих параметров позволяет эффективно разделять амплифицированные фрагменты ДНК, различающиеся даже всего на один нуклеотид.
Конформационный метод выявления точечных мутаций получил широкое распространение благодаря своей простоте и возможности обнаруживать любые типы замен. Эффективность детекции мутаций при размерах амплифицируемого фрагмента менее 200 п.о. составляет 70- 95%, но при длине фрагмента, превышающей 400 п.о., вероятность обнаружения мутаций уменьшается до 50%.
Смотрите также:
