Мутация структурная: идентификация
Идентификация мутантных аллелей, т. е. обнаружение нарушений в первичной нуклеотидной последовательности ДНК, является самым точным методом молекулярной диагностики наследственных заболеваний. Большие перестройки - делеции , дупликации , инверсии , транслокации - размером более 1 млн п.о., затрагивающие целые гены или даже несколько генов, могут быть обнаружены на цитологических препаратах с использованием карт высокого разрешения (анализ дифференциально окрашенных прометафазных хромосом). Еще большая разрешающая способность (до 50 тыс. п.о.) может быть достигнута при работе на специальным образом приготовленных (растянутых) интерфазных хромосомах с использованием техники гибридизации in situ ( FISH ).
Мутации, изменяющие длину рестрикционных фрагментов , могут быть выявлены путем блот-гибридизации рестрицированной геномной ДНК с соответствующими ДНК-зондами на стадиях генетического анализа, предшествующих молекулярному клонированию гена. К числу таких мутаций относятся достаточно протяженные, но не идентифицируемые цитогенетически, внутригенные делеции, инсерции и дупликации, а также точечные мутации , локализованные в сайтах рестрикции. Непременным условием реализации метода блот- гибридизации для поиска подобных мутаций является наличие ДНК- зонда, являющегося либо частью гена, либо тесно сцепленной с этим геном клонированной ДНК-последовательностью. При поиске таких мутаций геномную ДНК от здорового донора и больного обрабатывают часто щепящими рестриктазами, подвергают электрофорезу, блот- гибридизации с меченым ДНК-зондом по стандартной схеме и проводят сравнительный анализ расположения бэндов на радиоавтографе. Особенно информативными обычно оказываются рестриктазы Mspl и Taqi , которые узнают сайты CCGG и TCGA, соответственно. Благодаря наличию CpG-последовательностей, эти сайты особенно часто подвергаются спонтанному мутированию. Наличие протяженных делеций либо точечных мутаций в сайтах рестрикции приводит к изменениям размеров рестрикционных фрагментов.
Целенаправленный поиск других точечных мутаций (не затрагивающих сайты рестрикции) и небольших структурных аномалий возможен только для клонированных генов с известной нуклеотидной последовательностью смысловых участков ДНК. Методы идентификации подобных мутаций основаны главным образом на использовании полимеразной цепной реакции в ее различных модификациях.
Для анализа мутантных аллелей прежде всего необходимо иметь изолированные последовательности мутантного гена, которые могут быть получены либо путем клонирования или амплификации мутантной кДНК, либо за счет специфической амплификации отдельных экзонов, их частей и регуляторных областей гена с использованием в качестве матрицы геномной ДНК пациентов. В первом случае отбирают клонированные кДНК-последовательности мутантного гена, проводя скрининг библиотек кДНК, сконструированных из специфических тканей или культур клеток больного. При этом в качестве зондов используют последовательности кДНК нормального гена. Другим источником кодирующих последовательностей мутантного гена может служить мРНК, изолированная из экспрессирующих тканей или клеток больного. Мутантную кДНК получают путем специфической амплификации перекрывающихся последовательностей кодирующих областей гена, используя в качестве матрицы тотальную кДНК, полученную при обратной транскрипции изолированной мРНК.
Преимуществом этого подхода является то, что праймеры для амплификации выбирают из экзонных областей, нуклеотидные последовательности которых, как правило, становятся известны вскоре после идентификации и клонирования гена. В ряде случаев изоляция мутантной мРНК затруднена в связи с недоступностью образцов тканей или органов, в которых происходит экспрессия нужного гена (мозг, печень и др.). Однако обнаружение следовых количеств так называемой незаконной, или эктопической, мРНК во многих клетках и тканях, в том числе в клетках крови, позволяет преодолевать и эти трудности [ Kaplan J.-C. et al., 1992 ]. Успех подобной процедуры получения мутантной кДНК связан, в первую очередь, с разработкой эффективных методов выделения и обратной транскрипции мРНК с сохранением всех типов кДНК, включая те, для которых соответствующие мРНК присутствуют в ничтожных концентрациях (например, мРНК дистрофина при мышечной дистрофии Дюшенна . Единственным принципиальным ограничением методов детекции мутаций в последовательностях кДНК является невозможность выявления мутаций в регуляторных и интронных частях гена. Подобные мутации могут быть выявлены только при анализе геномной ДНК пациента.
Получение геномной мутантной ДНК обычно не представляет сложностей, так как она может быть изолирована из любых клеток или тканей больного независимо от характера экспрессии исследуемого гена. Однако амплификация целых экзонов возможна только при знании нуклеотидных последовательностей фланкирующих интронных областей, из которых и производят подбор специфических олигопраймеров. Секвенирование интронов представляет собой достаточно трудоемкую задачу, решенную далеко не для всех клонированных генов. Таким образом, к ограничениям этого подхода следует отнести необходимость достаточно полной информации о структуре гена и о его первичной нуклеотидной последовательности. Кроме того, объектом тестирования могут быть лишь сравнительно небольшие области гена, отсюда для получения более полной информации необходима амплификация многих экзонов.
Стратегия идентификации мутаций может быть различной и, в конечном счете, определяется тем, имеем ли мы дело с ранее неизвестными мутациями, либо целью анализа является скринирование уже известных мутаций. В первом случае объектом исследования чаще всего служат клонированные или амплифицированные последовательности кДНК, тогда как при молекулярной диагностике известных мутаций, как правило, анализируют амплифицированные фрагменты геномной ДНК.
Смотрите также:
