Генетический анализ рекомбинации у микроорганизмов
Выщепление транспозона - это генетически наиболее хорошо изученый пример рекомбинации между короткими гомологичными последовательностями . Папилляционным тестом были изолированы мутанты, которые стимулировали точное выщепление Tn10 (названые tex) (колонии, полученые из этилметансульфонат-мутагенизированых клеток, несущих Tn10 в гене lacZ, были отслежены на увеличение количества Lac+ papillae [ 79 ]). Многое из этого могло быть отнесено к ранее идентифицированым генам, вовлекаемым либо в направляемую метилированием репарацию несовпадений в ДНК (dam, mutH, mutL, mutS, mutU), либо в рекомбинацию (recBC гены [ 181 , 182 ]). Сортировка мутаций в других генах, участвующих в метаболизме ДНК, показала, что ssb и mutD также повышают частоту выщепления Tn10 [ 181 ]. При использовании похожего папилляционного теста были выделены другие мутации , стимулирующие выщепление транспозона, которые нельзя было отнесим к ранее идентифицированому гену (uup мутанты [ 114 ]). Различные мутации влияли на выщепление в различной степени [ 114 , 181 , 182 ]; так, мутации mutU, recBD и uup стимулировали в большей степени, примерно в 100 крат,; mutS и mutH - в меньшей, примерно в 2 раза.Одинаковые мутации по-разному влияли на выщепление из разных сайтов. Это было показано для мутации mutS, стимулирующей выщепление Tn10 в 2 раза из сайта lacZ и в 50 раз из сайта в гене hisG. Мутация mutL стимулировала выщепление в 11-раз из lacZ и из hisG в 50 раз.
Модель переключения матрицы в ДНК рекомбинации между короткими гомологичными последовательностями дает возможность интерпретировать эффект различных генов, которые вовлекаются в репарацию несовпадений, генерированных метилированием. Было предположено, что при репарации несовпадений происходит следующее [ 161 , 196 , 227 ]: (i) связывание белков MutL и MutS с сайтом несовпадения (показано in vitro для MutS; (ii) привлечение ДНК-геликазы II (продукт гена mutU, также известного как ген uvrD, uvrE, или recL [ 111 , 156 , 184 , 215 ]) на ДНК, облегченное предыдущим связыванием MutL и MutS; (iii) разделение нитей геликазой II; (iv) разрезание неметилированой нити белком MutH в последовательности GATC на любой стороне несовпадения (метилирование GATC опосредуется dam-метилазой [ 86 , 185 , 186 ]); и (v) репарация полученной бреши ДНК-полимеразой действует совместно с ss-связывающим белком [ 43 , 180 ].
Ошибки репликации, дающие несовпадающие нуклеотидные пары или неспареные основания, эффективно репарируются системой, направленной на метилирование. Та же система может репарировать репликационные ошибки,дающие шпильки и одноцепочечные петли. MutL и MutS могут прикрепляться к основанию этих структур, и процесс репарации может продолжаться по пути, предположенному для несов падающих оснований.Аргументом против этой модели является то, что были найдены большие одноцепочечные петли, содержащиеся в сформированых in vitro гетеродуплексах между фагом лямбда дикого типа и мутантным фагом, несущим ISI в гене c1, и не отрепарированных системой, направленной на метилирование [ 65 ].Тем не менее, система может действовать различным образом на гетеродуплексы и и на беспорядочные структуры, сформированые в течение репликации. Например,геликаза II может расплавлять короткие дуплексные районы ДНК возле образующихся концов. Таким образом, она должна будет уничтожить одноцепочечные петли, разрешив получающейся одиночной нити либо сплавиться с соответствующей гомологичной последова- тельностью, либо деградировать. Но такое расплавление и репарация могут быть менее эффективны, когда одноцепочечная петля удалена от конца или н е фланкирована прямыми повторами, как в случае изученых гетеродуплексов лямбда [ 65 ].
Эффективность репарации зависит от типа несовпадений ( транзи- ции репарируются более эффективно, чем трансверсии [ 66 ]) и последовательностей, фланкирующих несовпадения (она возрастает с увеличением содержания C+G в последовательностях, соседних с трансверсией [ 138 ]). Частота выщепления транспозонов также может зависеть от эффективности, с которой репарационная система работает на структурах, полученных в различных сайтах переключением матрицы. Влияние инактивации белков MutS и MutL на выщепление Tn10 зависит от сайта инсерции транспозона.
Недостаточность геликазы II стимулирует выщепление транспозонов больше, чем нехватка MutS и MutL [ 181 ]. Вероятно, кроме гипотетического прикрепления к сайтам белков MutS и MutL, геликаза насыщает такие сайты, как растущий конец нити ДНК или одноцепочечные петли. Больший эффект геликазной недостаточности должен, следовательно,отражать ее действие на различные промежуточные продукты при формировании делеций.
Влияние мутации в гене mutD (известном, как ген dnaQ, кодирующий субъединицу epsilon голофермента PolIII) на выщепление транспозонов также согласуется с моделью переключения матрицы. Oна инактивирует 3'-> 5' экзонуклеазную корректирующую активность этого репликационного фермента [ 183 ]. Вероятно, мутантный голофермент переключает матрицы более часто, чем голофермент дикого типа, так как кратковременно неспаренные 3'-концы не удаляются. Аналогично, мутация ssb может влиять на переключение матрицы, так как известно, что белок Ssb используется в репликации ДНК [ 43 ].
Некоторые изменения гена recBCD, продукт которого участвует в классической рекомбинации между длинными гомологичными последовательностями, также влияют на рекомбинацию между короткими гомологичными последовательностями. Гены recBCD кодируют экзонуклеазу V, обладающую многими ферментативными активностями [ 3 ]. Она действует как АТФ-зависимая экзонуклеаза на ssДНК. Она режет ДНК по специфическим 8-н.п. Chi-сайтам , разворачивает ДНК и генерирует одноцепочечные петли. Некоторые recBCD-мутации, обозначеные tex, стимулируют выщепление транспозонов Tn5 и Tn10 из хромосомы E.coli, остальные, недостающие в общей рекомбинации (recB21, recC22), не влияют на него [ 182 ]. Стимулирование изменяется от незначительного (в 1.3 раза) до резко выраженного (в 140 раз), и зависит от сайта инсерции транспозона и специфической мутации texA. Выщепление Tn9,имеющего длинные терминальные прямые повторы [ 146 ], не стимулировалось, что показывает обязательность инвертированных повторов. Стимуляция не отменялась на TexA Rec+ меродиплоидах, что предполагает модификацию, а не потерю, RecBCD активности. Рекомбинация между короткими прямыми повторами на плазмидах была стимулирована в десятикратном размере другой мутацией в генах recBCD (recD). Не наблюдалось стимуляции, если длинные инвертированые повторы были утеряны.
Привлекательная модель влияния меняющегося белка RecBCD основана на его ДНК-разворачивающей активности.
Смотрите также:
