Трансформация злокачественная с помощью ДНК опухолей
Доказательства многоступенчатой природы рака были получены в экспериментах по искусственному введению онкогенов в клетки. Если один онкоген переносится в культуру фибробластов хомяка, изменений в росте клеток не наблюдается. Если же одновременно переносятся два онкогена, трансформированные клетки растут ненормально быстро и при трансплантации мыши вызывают опухоли. Более того, не все комбинации онкогенов способны трансформировать клетки. Онкогены можно классифицировать по способности комплементировать друг друга в трансформационном анализе. Из этих опытов мы можем заключить, что клетки выработали несколько путей контроля роста и прежде, чем клетка выйдет из под контроля, более чем один из них должен быть поврежден.
В начале 80-х годов были получены оригинальные и принципиально важные по значению данные о переносе злокачественного фенотипа от опухолевых клеток к нормальным с помощью ДНК из трансформированных клеток ( Shih C. et al., 1979 , Shih C. et al., 1981 ). Фактически появилось первое прямое доказательство того, что признаки трансформации закодированы в ДНК.
Была выделена ДНК из клеток карциномы мочевого пузыря человека и путем трансфекции введена в линию мышиных клеток NIH 3Т3 . Эта линия является псевдонормальной. Она способна к неограниченному числу делений in vitro и, следовательно, прошла первый этап малигнизации , но не обладает другими признаками трансформированного фенотипа , такими, как морфологические изменения, уменьшение потребности в ростовых факторах , отсутствие контактного торможения (способность к многослойному росту), независимость роста от прикрепления к субстрату, прививаемость (способность образовывать опухоли у сингенных животных).
О способности ДНК из клеток карциномы вызывать злокачественную трансформацию судили по появлению в культуре трансфецированных NIH 3T3 клеток многослойных фокусов морфологической трансформации. Оказалось, что этот признак можно было передавать не только путем первичной трансфекции клеток с помощью ДНК опухолевых клеток, но и при повторных циклах трансфекции с помощью ДНК, выделенной из клеток первичных трансформантов (из клонов с многослойным ростом) ( Shih C. et al., 1981 ). Гибридизационный анализ показал присутствие ДНК человека во вторичных и последующих трансформантах ( Parada L.F. et al., 1982 ).
Использование в качестве зондов последовательностей различных v-onc , а также c-Ha-ras1 крысы позволило установить гомологию трансформирующего гена из карциномы мочевого пузыря человека с генами v-Ha-ras и с-Ha-ras1 крысы ( Parada L.F. et al., 1982 ). Секвенирование этого гена и сравнение его структуры с протоонкогеном с-Ha-ras , выделенном из нормальных клеток человека, показало, что он отличается от своего нормального аллеля заменой всего лишь одного основания в 12-ом кодоне, приводящей к замене в кодируемой геном полипептидной цепи глицина на валин ( Tabin C.J. et al., 1982 ).
Дальнейшие исследования с помощью метода трансфекции ДНК показали, что успешный перенос трансформированного фенотипа может быть осуществлен с помощью ДНК из разных опухолей разного видового происхождения, возникающих спонтанно и индуцированных канцерогенами ( Cooper G.M. et al., 1980 , Krontiris T. G., Cooper G.M., 1981 , Perucho M. et al., 1981 ).
Метод переноса ДНК позволил обнаружить в клетках нейробластомы человека неизвестный ранее ген N-ras ( Shimisu K. et al., 1983 ). Необходимо отметить, что в подавляющем большинстве случаев данным методом выявлены гены, принадлежащие к ras-семейству : c-Ha-ras1 , c-Ki-ras2 и N-ras ( Barbacid M., 1987 ). Другие гены с помощью такого подхода тестировались крайне редко. Тем не менее было выявлено несколько новых онкогенов: c- erb2 , trk , c-met , hst , dbl ( Marshall C.J., 1989 ).
Несмотря на то, что метод переноса ДНК не выявил большого количества новых онкогенов, он продемонстрировал значительную роль активированных клеточных онкогенов ras-семейства в формировании опухолей человека. Их присутствие в 10-30% опухолей определило интерес к данной группе генов в 80-е - 90-е годы.
Смотрите также:
