Векторы-переносчики генов: обшие сведения
Существуют вирусные и невирусные векторы-переносчики генов ( табл. 31.1 ). Вирусы служат удобным средством доставки генетической информации в клетки. Оболочка вирусов позволяет осуществить перенос генетической информации в клетки-мишени ( рис. 31.1 ). Векторная ДНК не может реплицироваться и создавать новые вирусные частицы в отсутствие вирусных генов. Структура гена многих векторов содержит вирусную ДНК только на обоих концах, при этом ДНК не кодирует вирусные гены ( рис. 31.1 ). Структура концов вирусного вектора служит для распознавания векторной ДНК с целью ее включения в инкапсулированные частицы вириона . В тех случаях, когда вирус применяется в качестве вектора, проблемы безопасности терапии включают возможность случайного непредсказуемого синтеза вируса дикого типа (вызывающего заболевание).
В настоящее время разрабатываются методы введения ДНК в организм без участия вирусов. Эти методы включают введение изолированной ("голой") ДНК и применение сложных химических соединений, включающих ДНК ( табл. 31.1 ). Одно из важных ограничений этих методов - проблемы безопасного переноса генов в специфические органы в сочетании с их терапевтической эффективностью, приводящей к стойкой экспрессии генов. В целом в настоящее время вирусные векторы имеют много преимуществ в отношении их эффективности, однако в будущем, вероятно, будут более широко применяться невирусные векторы.
Ретровирусные векторы применяются наиболее часто. В клинике используются ретровирусные векторы, созданные на основе мышиного ретровируса Молони (Moloney). Эти векторы, освобожденные от всех вирусных генов, имеют относительно длинный и безопасный период экспрессии. Для создания вектора упакованные клеточные линии постоянно подвергаются воздействию всех вирусных генов, требуемых для репликации и упаковки генома используемого вектора ( рис. 31.1 ). Векторные последовательности, содержащие терапевтический ген, фланкированы структурной последовательностью вируса и упаковочным сигналом. Нуклеотидная последовательность, необходимая для упаковки ДНК вектора в вирион, фланкирует ген экспрессии . Благодаря этому только нуклеотидные последовательности вектора, кодирующие терапевтический ген, упакованы в вирусную частицу. Вектор, геном которого содержит только терапевтический ген при отсутствии вирусных генов, переносится к клеткам-мишеням и осуществляет трансдукцию . Происходит интеграция терапевтических генов, содержащихся в вирусных векторах, в хромосомы клетки-мишени. Сохранение стабильного переноса гена зависит от продолжительности жизни модифицированной клетки и ее предшественниц. Этот факт открывает перспективы для лечения генетических заболеваний, при которых необходима пожизненная экспрессия гена.
Однако, даже если эти векторы имеют длительный безопасный период экспрессии при исследованиях на животных и при клинических испытаниях у людей, проблема состоит в том, что любой вектор обладает потенциальной возможностью инициировать инсерционный мутагенез , вызывая инактивацию или гиперактивацию независимых генов клетки, которые могут быть вовлечены в канцерогенез . Трансдукция такого вектора осуществляется только в активно делящиеся клетки. В каждый момент времени большинство клеток ткани находится в неделящемся состоянии. В отсутствие стимуляции клеточного деления эффективность генного переноса низка. Большинство клинических протоколов с использованием ретровирусных переносчиков основано на исследованиях ex vivo, в которых возможно воздействие на культивируемые клетки пациента (клетки костного мозга) с целью активации их деления. Более новые, созданные на основе ретровирусов векторы, происходящие от лентивирусов , таких как ВИЧ , возможно, имеют преимущества, так как могут внедряться в клетки некоторых типов, не находящихся в процессе активного деления.
При использовании любых вирусных векторов возникают проблемы, связанные со сходством (перекрыванием) нуклеотидных последовательностей вектора и вируса дикого типа, что может привести к рекомбинации вектора и синтезу вируса дикого или измененного типа. Однако дизайн современных вирусных векторов позволяет максимально устранить перекрывающиеся нуклеотидные последовательности или сделать их очень короткими, так что рекомбинация становится маловероятной.
Рекомбинантные аденовирусные векторы не интегрируют в геном и могут произвести трансдукцию большой части клеток различных тканей ( рис. 31.1 ). Геномная структура аденовируса сложнее, чем структура ретровируса, поэтому удалить все вирусные гены из аденовирусного вектора труднее. В ранних вариантах аденовирусных векторов поддерживался невысокий уровень транскрипции сохраненных вирусных генов, что обусловливало некоторую степень токсичности и иммуногенности векторов. Несмотря на то, что применение аденовирусных векторов открывает перспективы в лечении таких заболеваний, как рак , токсичность вектора может привести к неблагоприятным последствиям (например, зарегистрирован летальный исход, обусловленный векторной токсичностью, у молодого мужчины после внутрисосудистого введения аденовирусного вектора). Доклинические исследования позволяют предположить, что векторы, лишенные любых вирусных генов, обладают значительно более низкой токсичностью.
Рекомбинантные вирусные векторы получены из непатогенных человеческих парвовирусов. Эти векторы отличаются значительным периодом безопасной экспрессии и трансдукцией клеток многих тканей, включая мышцы и печень. Проводятся клинические испытания векторов этого типа при муковисцидозе , гемофилии и мышечной дистрофии . Основным недостатком векторов этого типа является их маленький размер, в связи с чем они не могут переносить очень крупные гены, что ограничивает их применение при некоторых заболеваниях.
Вирусы герпеса, возможно, наименее понятны. Они отличаются крупным размером, большой емкостью ДНК и эффективной трансдукцией многих тканей, включая ЦНС. Сейчас проводятся доклинические исследования, и, наверное, в скором времени начнутся клинические испытания в этой области
Невирусные векторы конструируют различными способами. Они обычно содержат ДНК в комплексе с липидами, углеводами, белками и/или синтетическими химическими компонентами, которые облегчают доставку вектора или повышают его стабильность. Возможен перенос генов и с помощью голой ДНК, однако низкая эффективность этого процесса ограничивает его применение. Перспективность применения невирусных векторов обусловлена отсутствием риска вирусной контаминации с возможностью их получения в более контролируемых условиях. К их основным недостаткам относится низкая скорость переноса генов, по крайней мере по сравнению с большинством вирусных векторов. Новые методы, включающие совместную экспрессию вектора с белковыми молекулами, позволяют векторспецифическую интеграцию в культурах клеток или в организме животных. Несмотря на хорошие предварительные результаты, необходимы дополнительные исследования, подтверждающие безопасность этих методов до их внедрения в клиническую практику.
При создании вирусных векторов опираются на известные механизмы, с помощью которых родительский вирус дикого типа инфицирует клетки. Поэтому представляет большой интерес создание гибридных векторов, обладающих желаемыми свойствами двух разных векторов, объединенных в единый вектор. В перспективе такие вирусные векторы могут быть синтезированы из нескольких вирусов или представлять комбинацию вирусных и невирусных компонентов.
Поскольку многие векторы, находящиеся в процессе изучения, получены из вирусов, подобных тем, что вызывают инфекцию, гуморальный иммунитет может подавлять вторичный перенос гена при повторном введении вектора. В этих случаях при повторном введении может потребоваться вектор, полученный из вируса другого серотипа.
Смотрите также:
