Эритропоэтин: характеристика биохимическая
Эритропоэтин человека представляет собой гликопротеид , в котором на долю углеводного компонента приходится 40-50% молекулярной массы (молекулярная масса гликопротеида 32-36 кД, а расчетная молекулярная масса белковой части - 18399 Д) ( Egrie J. et al., 1986 , Lin F.-K. et al., 1985 ) Величина изоэлектрической точки эритропоэтина низкая (рН 3,5-4,0), что обусловлено наличием сиаловых кислот в терминальных положениях углеводных цепочек эритропоэтина ( Sherwood J., 1984 ). Изоэлектрическая фокусировка плазменного эритропоэтина в полиакриамидном геле позволяет выявить несколько фракций, идентичных по молекулярной массе, но различающихся по величине их изоэлектрических точек, что свидетельствует о гетерогенности в структруре углеводной части гормона ( Espada J. et al., 1974 ). Отщепление сиаловых кислот при обработке нейраминидазой или при кислотном гидролизе приводит к потере стабильности гормона in vivo, но не влияет на его активность in vitro ( Goldwasser E. et al., 1974 , Lukowsky W., Painter R., 1972 ).
В результате анализа аминокислотной последовательности эритропоэтина человека выявлено 3 потенциальных сайта N-гликозилирования , которые включают консенсус-последовательность Asn-X-Ser/Thr ( Lin F.-K. et al., 1985 , Lai F. et al., 1986 ). В экспериментах по обработке гормона N- гликозидазой , специфически отщепляющей олигосахаридные цепочки, связанные с аспарагиновым остатком N-гликозидной связью, было подтверждено предположении о наличии 3 сайтов N-гликозилирования в молекуле эритропоэтина ( Lai F. et al., 1986 ). В результате экспериментов по обработке гормона О-гликозидазой установлено, что эритропоэтин содержит также олигосахаридные цепочки, связанные с белковой частью посредством О- гликозидных связей ( Egrie J. et al., 1986 ).
При исследовании свойств рекомбинантного эритропоэтина, продуцируемого клетками насекомых, было показано, что наличие неполного углеводного компонента (молекулярная масса эритропоэтина, синтезированного в этой системе равна 23 кД) не влияет на активность гормона in vitro, но значительно снижает его активность in vivo.
В то же время полное отщепление углеводной части с помощью гликозидаз приводит к 80%-ной потере биологической активности гормона в тесте in vitro ( Wojchowski D. et al., 1987 ). Эти данные находятся в противоречии с существующими представлениями о том, что углеводный компонент эритропоэтина не является строго необходимым для его активности in vitro ( Dordal M. et al., 1985 ).
Takenchi M. et al., 1989 провели детальный анализ структуры рекомбинантного эритропоэтина, полученного с помощью трансфекции клеток из яичника китайского хомячка линии CHO в геном эритропоэтина человека. Было установлено, что в клетках линии CHO синтезируются 2 типа эритропоэтина (названных би- и тетра-формами), различающихся по степени разветвления N- связанных углеводных цепочек. Би-форма эритропоэтина , содержащая менее разветвленный углеводный компонент, существенно отличается по биологической активности от нативного эритропоэтина, используемого в качестве стандарта: биологическая активность би-формы эритропоэтина in vivo в 7 раз ниже, а in vitro - в 3 раза выше. Биологическая активность тетра-формы эритропоэтина очень близка к активности нативного эритропоэтина. Эти данные указывают на существенную роль структуры углеводного компонента для биологической активности эритропоэтина in vivo. По-видимому, более высокая активность in vitro тех форм эритропоэтина, которые содержат неполный углеводный компонент, связана с облегчением взаимодействий эритропоэтина с рецепторами. В то же время, по-видимому, именно углеводный компонент обеспечивает стабильность гормона в организме и соответственно высокий уровень биологической активности в тестах in vivo.
Смотрите также:
