Папаин
Источник: Т.А.Валуева
Папаин (КФ 3.4.22.2) является одним из протеолитических ферментов, присутствующих в латексе дынного дерева (Carica papaya L.). Название "папаин" было впервые предложено в конце 19-го века А.Вюрцем и Е.Бошутом и используется до настоящего времени для обо- значения препаратов латекса.
Фермент содержится во всех частях растения за исключением корней. Неочищенный или частично очищенный папаин в прошлом был об`ек- том многочисленных исследований. Однако, позднее было установлено, что сухой латекс дынного дерева, кроме папаина, содержит целый набор цистеиновых протеиназ, которые разделяются на три главные группы: собственно папаин, химопапаины А и В (КФ 3.4.22.6) и пептидазы А и В (КФ 3.4.22.6). В последние годы папаин и химопапаины были обнаружены также в латексе из вегетативных органов (листьев и череш- ков) дынного дерева. В 1937 г. .Болз и др. впервые получили крис- таллический папаин, а в 1941 г. .Янсен и .Болз - кристаллический химопапаин.
Три главные группы ферментов латекса папайи различаются по физико-химическим свойствам. Так, они характеризуются разными значе- ниями изоэлектрических точек, которые находятся в зоне рН 9,5, 10,1-10,6 и 11,1 для папаина, химопапаинов и пептидаз, соответст- венно. Различаются эти группы ферментов и по содержанию титруемых свободных SH-групп. Ферменты первой и третьей групп содержат 1 SH-группу на молекулу белка, ферменты второй группы - 2.
Папаин является наиболее изученным ферментом, хотя на его долю приходится только около 5: общего содержания растворимого белка ла- текса дынного дерева. Молек. масса фермента, определенная Э.Смитом и др. на основании скорости седиментации и диффузии, равна 20,7 кДа. Эта величина значительно ниже значения, полученного .Болзом и Г.Лайнуивером (27 кДа) осмометрическим методом.
Молекула папаина состоит из одной полипептидной цепи и содержит 212 аминокислотных остатков. Характерной особенностью аминокислот- ного состава фермента является отсутствие остатков метионина.
Папаин относительно устойчив в нейтральной и слабощелочной сре- де, но быстро и необратимо теряет активность в области кислых зна- чений рН. По сравнению с другими протеиназами растительного проис- хождения (например бромелаином и фицином) папаин проявляет значите- льную устойчивость к действию повышенных температур. Фермент стаби- лен в лиофилизованном неактивированном состоянии. Потеря активности в водных растворах происходит медленно, но зависит от температуры хранения. При инкубации в присутствии активаторов папаин теряет ак- тивность в результате автолиза. Впервые процесс автолиза папаина наблюдали при ионнообменной хроматографии. Медленное протекание процесса автолиза является причиной того, что даже наиболее актив- ные препараты фермента оказываются загрязненными низкомолекулярными продуктами.
Молекула папаина обладает высокой устойчивостью к денатурирующим воздействиям. Так, оптическое вращение папаина существенно не меняется в 6-8 М растворе мочевины или в 70%-ном метиловом спирте.
Кристаллический папаин обладает, как правило, низкой активностью в отсутствие активаторов. В роли активаторов могут выступать различные низкомолекулярные тиолы, цианиды и ряд других веществ, обладающих свойствами восстановителей, например цистеин, глютатион, тиогликолевая кислота, тиосульфат и боргидрид натрия.
Для получения максимальной активности папаина необходимо одновременное присутствие восстановителя и веществ, способных связывать ионы металлов. Например, используют смесь цистеина (0,005 М) с эти- лентетрауксусной кислотой (0,002 М) или с версеном (0,001 М). Эта смесь может быть успешно заменена 2,3-меркаптопропанолом, соединением, которое способно одновременно связывать металлы и действовать как восстановитель. Максимальная активность папаина в присутствии активаторов достигается через 5-10 мин.
Природа активаторов, а также отношение папаина к окислительным агентам и веществам, специфически блокирующим сульфгидрильные груп- пы белков, позволили давно сделать вывод, что папаин относится к классу цистеиновых протеиназ. По данным .Финкеля и .Смита содержание тиоловых групп у неактивного папаина менее 0,5 моля на моль белка и это же количество определяется при различных способах денатурации фермента. В то же время в активированном папаине присутст- вует до 1 моля SH-групп на моль белка. Более того, существует кор- реляция между содержанием тиоловых групп в молекуле папаина и его удельной активностью.
Исследования механизма процесса активации и природы неактивной формы папаина позволили И.Клейну и Дж.Киршу, а также .Слайтерман получить убедительные доказательства того, что основной компонент неактивного папаина представляет собой смешанный дисульфид белок- цистеин. Активация папаина KCN, вызывающая освобождение SH-группы, сопровождается образованием эквивалентного количества 2-иминотиазолидин-4-карбоновой кислоты. Это соединение образуется в результате циклизации и-тиоцианаталанина, который синтезируется при взаимодействии цианида с небелковым остатком цистеина (рис. 1.65). В присутствии кислорода воздуха может протекать обратная реакция, ведущая к связыванию цистеина с SH-группой активного центра папаина с образованием неактивного продукта. В 1969 г. .Бэрелом и А.Глей- зером было показано, что процесс активации папаина не сопровождает- ся заметными конформационными изменениями в белковой молекуле.
Все ферменты латекса папайи являются цистеиновыми протеиназами. Они катализируют реакцию гидролиза белков по пептидным связям'
P -...-P -P CO-NHP'-P'-...-P' + H O
P -...-P -P COOH + NH P'-P'-..-P', где P и P' - остатки аминокислот.
Различные протеиназы латекса папайи обладают сходной специфич- ностью действия на белковые субстраты. Они способны гидролизовать практически любые пептидные связи, за исключением связей, образо- ванных остатками пролина. Предпочтительно расщепляются связи, в об- разовании которых в качестве остатка P участвуют глицин, гидрофоб- ные (лейцин, изолейцин), ароматические (тирозин, фенилаланин) ами- нокислоты, а также аспарагиновая, глутаминовая и цистеиновая кисло- ты. Важное значение при этом имеет и природа остатков P и P'. Так, при действии на В-цепь окисленного инсулина пептидная связь между Leu-17-Val-18 гидролизуется только папаином, связь между Arg-22- Пдн-23 - только химопапаином и между Leu-15-Tyr-16 - только пепти- дазой А.
Протеиназы латекса обладают высокой протеолитической активно- стью в широком интервале значений рН. При этом папаин и пептидаза А гидролизуют гемоглобин, казеин и бычий сывороточный альбумин с наи- большей скоростью в зоне рН от 7,2 до 10, химопапаин проявляет наи- высшую активность в зоне рН от 5,0 до 7,0.
Протеиназы латекса папайи способны катализировать гидролиз ряда синтетических эфиров и амидов аминокислот и пептидов'
R-С(=O)-R' + H O R-С(=O)-OH +HR', где R - остаток ациламинокислоты или ацилпептида, R' - остаток ами- нокислоты, спирта или гамма-нитроанилина.
Протеиназы латекса различаются по характеру действия на низко- молекулярные синтетические субстраты. Из таких субстратов наиболее предпочтительными являются эфиры и амиды N,альфа-бензоил-L-аргини- на. При этом скорость их расщепления папаином выше, чем химопапаи- ном и пептидазой А. Этиловые эфиры N-ацетил-L-тирозина, N-бензо- ил-L-тирозина и N-бензиол-L-лейцина полностью устойчивы к действию всех протеолитических ферментов латекса, в то время как амид бензо- илглицина, некоторые производные L-лейцина и карбобензокси-L-глута- мил-L-тирозина медленно гидролизуются только химопапаином. Папаин эффективно гидролизует п-нитроанилиды пироглутамил-L-фенил- ала- нил-L-R, где R - остаток лейцина или аланина. Менее эффективно на такие субстраты действует пептидаза А.
Первичная структура папаина приведена на рис. 1.66. Шесть из семи содержащихся в молекуле остатков Cys участвуют в образовании трех дисульфидных мостиков, которые соединяют остатки полуцистина в положениях 22-63, 56-93 и 153-200. Единственная сульфгидрильная группа принадлежит остатку цистеина, расположенному в положении 25. Этот остаток является частью каталитического центра фермента.
Трехмерная структура папаина была установлена с помощью рентге- ноструктурного анализа с разрешением в 2,8 А (рис. 1.67).
Существенный интерес представляют экспериментальные данные о сохранении ферментативной активности у кристаллов папаина, выращен- ных в метиловом спирте и помещенных затем в 20%-ный раствор Na SO . Эти данные в совокупности с отмечавшимся выше сходством оптических свойств папаина в водном растворе и в 70%-ном метиловом спирте по- зволили сделать важный вывод о том, что конформация молекулы папаи- на в белковых кристаллах близка к конформации в водном растворе.
Молекула фермента имеет близкую к сферической форму с размерами 36 х 48 х 36 А и состоит из двух доменов, обозначенных как L- и R-домены. Домены разделены глубоким "желобом", на поверхности кото- рого находится активный центр фермента. Оба домена содержат практи- чески одинаковое число аминокислотных остатков. Так, L-домен вклю- чает остатки с 12 по 112 и с 208 по 212, а R-домен - остатки с 1 по 11 и с 113 по 207. Положение одного домена относительно другого поддерживается с помощью трех отрезков полипептидных "хребтов", пе- ресекающих основание "желоба", и множеством водородных связей, а также электростатическими и гидрофобными взаимодействиями боковых групп аминокислотных остатков полипептидной цепи. В L-домене при- сутствуют три отрезка альфа-спирали, охватывающие остатки 26-41, 50-56 и 69-78, в R-домене - один короткий отрезок альфа-спирали (остатки 163-172) и небольшой фрагмент бета-структуры (остатки 163-172). Центральная область R-домена представляет собой гидрофоб- ное ядро, в котором 12-14 остатки Leu, Val и Phe взаимодействуют между собой.
В целом спирализованные участки в молекуле папаина охватывают около 20% всех аминокислотных остатков, входящих в состав белковой молекулы. Это значение согласуется с содержанием альфа-спиральных участков, рассчитанным на основании результатов измерения дисперсии оптического вращения. В молекуле папаина присутствуют пять внутри- молекулярных солевых мостиков, образованных гуанидиновыми группами остатков аргинина и карбоксильными группами остатков дикарбоновых аминокислот. Один такой мостик располагается внутри молекулы, а че- тыре - на ее поверхности.
Каталитический участок папаина длиной 2 нм и глубиной 5 А нахо- дится на поверхности "желоба" между двумя доменами. Расположение аминокислотных остатков в районе активного центра папаина приведено на рис. 1.68. Остаток СySH-25 локализуется на "желобе" в N-концевой области самой длинной центральной альфа-спирали между остатками 24-42. К боковой цепи СySH-25 примыкает атом азота N имидазольного коль- ца His-159. Имидазольная группа His-159 удалена от тиоловой группы CySH-25 на расстояние, не превышающее 5 А, что позволило прийти к заключению о взаимодействии между атомом серы остатка CySH-25 и атомом азота, N , His-159 за счет сил Ван-дер-Ваальса. Другой атом азота, N , имидазольной группы His-159 связан водородной связью с кислородом, O , боковой цепи остатка Asn-175. Таким образом, в ка- талитическом активном центре молекулы папаина существует триада CySH...His...Asn, напоминающая триаду Ыук...His...Asp, присутствую- щую в активном центре сериновых протеиназ.
По мнению Э.Бекера и Дж.Дрента у цистеиновых протеиназ водород- ная связь между остатками His-159 и Asn-175, защищенная от внешнего воздействия растворителя индольным кольцом Trp-177, выполняет ори- ентирующую роль. Так, при изучении структуры различных форм папаина (неактивной, инактивированной, но сохраняющей способность активиро- ваться, и активной) с использованием методов рентгеноструктурного анализа было показано, что имидазольное кольцо His-159 может менять свою ориентацию в ответ на изменения положения атома серы CySH-25. В молекуле неактивного папаина, тиоловая группа которого окислена до SO или SO , атом серы локализуется на расстоянии 2 А ниже плос- кости, в которой располагается имидазольное кольцо His-159. В моле- куле инактивированного, но способного активироваться, папаина атом серы расположен выше плоскости имидазола этого остатка гистидина, и имидазольное кольцо может вращаться под углом 30 относительно свя- зи С -С полипептидной цепи. Угол вращения имидазольного кольца в том случае, когда в молекуле фермента полностью восстановлена SH-группа, не удалось установить. Однако, как предполагают Л.Полгар и Дж.Дрент, вполне возможно, что у активированного папаина элект- ронные плоскости атома серы и имидазольного кольца пересекаются.
В формировании субстратсвязывающего участка активного центра папаина участвует остаток Gln-19, амидная группа боковой цепи кото- рого образует водородную связь с кислородом Ser-176. С другой сто- роны этого остатка находится "карман", образованный боковыми цепями остатков Tyr-67, Pro-68, Trp-69, Phe-207, Val-157 и Ala-163. Такой карман служит для связывания неполярной боковой цепи молекулы суб- страта.
Стенки "желоба", в котором расположен активный центр папаина, с одной стороны составляют боковые цепи остатков Trp-177 и His-159, а с другой - полипептидные цепи остатков 22-24 и 64-67. При этом кар- боксильная группа остатка Asp-64 и -NH- и -C=O группы остатка Gly- 66, а также -С=O группа остатка Asp-158 выступают в пространство "желоба" и обладают потенциальной способностью взаимодействовать с боковыми цепями субстрата.
Единственной заряженной группой, расположенной в пределах 10 А от CySH-25б является карбоксильная группа остатка Asp-158, локали- зованная от него на расстоянии 7 А. Степень участия этой группы в каталитическом акте до настоящего времени остается невыясненной.
Как и у сериновых протеиназ, реакция цистеиновых ферментов с субстратом представляет собой трехступенчатый процесс, включающий образование соединения типа ацил-фермент в качестве промежуточного соединения. Образование соединения типа ацил-фермент было экспери- ментально показано еще в 1964 г. .Бендером и Г.Лоу в реакциях, ка- тализируемых папаином и фицином. Так, в процессе гидролиза N-транс-циннамоилимидазола папаином образуется транс- циннамоилпапаин, спектральная характеристика которого соответство- вала соединению типа тиолового эфира. В качестве субстрата для фи- цина использовали метилтиогиппурат (тиоловый эфир). В ходе фермен- тативной реакции наблюдали образование дитиолового эфира, который характеризуется максимумом поглощения при 305 нм. Таким образом, в процессе реакций, катализируемых цистеиновыми протеиназами, проис- ходит ацилирование SH-группы активного центра. Соединения типа ацил-папаин могут быть устойчивыми при умеренно кислых значения рН. В частности, транс-циннамоилпапаин был препаративно выделен .Бен- дером и .Брубахером.
В настоящее время предложен следующий механизм действия папаина (рис. 1.69). Показано, что SH-группа CySH-25 имеет значение рК 4,0, а имидазольная группа His-159 - pK 8,5, и эти остатки нахо- дятся в активном ферменте в кислой форме в виде ионной пары S /H Im. Гистидин в процессе ферментативной реакции протонирует карбонильный углерод гидролизуемой связи, тогда как цистеин отдает протон на отщепляемую группу молекулы субстрата и атакует карбо- нильный углерод субстрата с образованием тиолового эфира. Образо- вавшийся тиоэфир может гидролизоваться в результате нуклеофильной атаки OH группы молекулы воды.
Постоянным источником противоречий в исследованиях механизма действия папаина является интерпретация роли карбоксильной группы Asp-158. Вначале предполагали, что влияние этой группы обеспечивает низкое значение рК SH-группы остатка CySH-25. По данным рентгено- структурного анализа показано, что карбоксильная группа Asp-158 связана водородной связью с -NH-группой остатка Ala-136, располо- женного в главной цепи молекулы. Эта группа оказывается удаленной от каталитического участка на расстояние 7,5 А от CySH-25 и 5,5 A от His-159, что затрудняет прямое включение карбоксильной группы
Смотрите также:
