Ретровирусные векторы
Ретровирусный вектор (retroviral vector, лат. retro- — приставка, означающая «направленный назад», «обратно», и virus — яд; лат. vector — везущий, несущий) - вектор, содержащий элементы генома ретровируса, необходимые для его репликации в клетках. В наиболее простом варианте из вирусного генома удаляют гены, кодирующие специфические антигены (gag), обратную транскриптазу (pol) или белки оболочки вируса (env), и вместо них вставляют селективный маркерный ген (напр., ген неомицинфосфотрансферазы). Обычно ретровирусный вектор содержит также дополнительно полилинкер, позволяющий клонировать в нем чужеродные гены, и ген, позволяющий проводить отбор клеток с интегрированным ретровирусным вектором на селективной среде. Ретровирусный вектор сохраняет присущую ретровирусам способность внедряться в геном клеток-хозяев и размножаться в них, но только в присутствии вируса-помощника. Ретровирусный вектор используют для эффективного встраивания чужеродной ДНК в геном эукариотических клеток, однако он имеет ряд свойств, ограничивающих практическое использование в медицине. В частности, ретровирусный вектор при внедрении в геном может вызывать инсерционные мутации, приводящие к различным патологиям организма. Кроме того, т. к. репликация ретровирусного вектора, также как и природных ретровирусов, осуществляется с чередованием пребывания генома в виде ДНК (провирус) и РНК (геном вирусных частиц), при клонировании в ретровирусный вектор фрагментов ДНК, содержащих интроны, последние, как правило, утрачиваются в результате сплайсинга. Тем не менее ретровирусный вектор продолжают использовать в экспериментальной биологии, а также для генной терапии.
Использование ретровирусных векторов, не способных к самостоятельной репликации, обеспечивает эффективное встраивание чужеродной ДНК в геном и постоянство генетических изменений. Однако эти векторы встраиваются только в делящиеся клетки, могут вызывать инсерционные мутации, дают сравнительно низкие титры рекомбинантного вируса, а экспрессия встроенного гена часто уменьшается до очень низкого уровня через несколько месяцев.
Тем не менее, для доставки трансгенов в организм человека в целях генотерапии ретровирусные векторы используются наиболее широко. Для введения чужеродной ДНК в геном животного можно использовать рекомбинантные ретровирусы. Преимуществами ретровирусов является то, что интеграция в этом случае происходит по известному механизму, в один сайт на хромосоме встраивается только одна копия и не происходит перегруппировок встроенного материала. Еще одно их достоинство - легкость доставки на различных стадиях развития. Преимплантационный эмбрион может быть обработан либо концентрированными вирусными штоками, либо путем совместного культивирования в монослоях с клеточной линией, продуцирущей ретровирус. Можно использовать и постимплантационный эмбрион. Всем хороши ретровирусы для последней цели, но клетки зародышевых линий инфицируются с низкой частотой и поэтому эффективность получения трансгенного животного понижается.
Специфичность взаимодействия ретровирусов с поверхностью клеток-мишеней в момент заражения обеспечивается белком оболочки их вириона, кодируемого геном env , продукт которого контактирует с белком-рецептором заражаемых клеток. Это создает предпосылки для направленного изменения круга хозяев вируса, т.е. клеток, которые он может заражать, путем изменений белка вирусной оболочки. Многие ретровирусы обладают узким кругом хозяев, ( экотропные вирусы ), например, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) , который способен заражать лишь субпопуляцию лимфоцитов, экспрессирующих на своей поверхности рецептор CD4.
Наиболее пристальное внимание как к средству доставки трансгенов при генотерапии уделяется вирусу лейкоза мышей Молони (MoMLV) , который обладает способностью заражать практически все исследованные клетки грызунов. Вирусы группы MoMLV-А способны заражать большое число клеток млекопитающих, включая клетки человека. Вирусы с широким кругом хозяев получили название амфотропных .
Разрабатываются три основные стратегии искусственного изменения тропизма (круга хозяев) вирусов: прямое изменение последовательности нуклеотидов гена белка оболочки ретровирусов, соединение белка оболочки с новыми лигандами и псевдотипирование.
Недостаток ретровирусных векторов - ограничение размера ДНК, которую можно переносить с их помощью. Только фрагменты, не превышающие примерно 10 килобаз, могут транспортироваться в геномы таким путем.
Ретровирусы, как бы самой природой, подготовлены для генных инженеров, чтобы использовать их в качестве векторов для переноса генетического материала в геном того организма, который сии генные инженеры намереваются изменять: Они стабильно внедряются в геном, они способны вносить в этот геном чужую ДНК. А в дополнение еще одно прекрасное качество: можно выкинуть вирусные гены (gag, pol, env) и вместо них между двумя LTR вставить то, что генному инженеру нужно, и сохранить при этом потенциал встраивания и переноса чуждой ретровирусу информации в геном хозяина. Давайте посмотрим как это делается с помощью клеточных линий, пакующих .
Ретровирусный вектор самоинактивирующийся
Ретровирусные векторы в генной терапии
Смотрите также:
