Генетическая организация гепаднавирусов и взаимодействие с клеткой
Геном гепаднавирусов представлен кольцевой двунитевой ДНК, которая имеет две особенности: во-первых, минус-цепь ДНК полная [(3,0-3,3)х1000 н.о.], а плюс-цепь неполная и охватывает лишь около 60% полной длины; во-вторых, кольцевая конфигурация ДНК формируется не ковалентным связыванием 5'- и З'-концов, а наличием нахлеста (240 н.о. - у представителей Orthohepadnavirus и 50 н.о. - у Avihepadnavirus ) между 5'-концами цепей ДНК. 5'-конец минус-цепи ДНК имеет небольшую (порядка 10 н.о.) избыточность по сравнению со строго кольцевой формой и ковалентно связан с так называемым белком TP (terminal protein - терминальный белок) , являющимся одним из доменов вирусной ДНК-полимеразы. (ДНК-полимераза гепаднавирусов состоит из N-концевого TP-домена, обладающего способностью инициировать синтез ДНК без нуклеотидного праймера, спейсерного домена и ОТ-домена, обладающего активностью РНКазы Н). 5'-конец плюс-цепи ДНК ковалентно связан с 19- членной 5'- кэпированной РНК, являвшейся затравкой для синтеза этой цепи.
В геномной ДНК гепаднавирусов имеется два идентичных прямых инвертированных повтора, DR1 и DR2 (direct repeats), длиной 11-15 н.о. 5'-конец минус-цепи ДНК (за исключением избыточного 5'-фрагмента) находится в области DR1, а затравочный РНК-фрагмент, ковалентно связанный с 5'-концом ДНК, комплементарен DR2 ( рис. 2.31 , А).
Взаимодействие вириона с клеткой-мишенью начинается со специфического связывания L-HBsAg с клеточными рецепторами, после чего происходит слияние вирусной и клеточной мембран, транспортировка нуклеокапсида в клеточное ядро и высвобождение вирусного генома в нуклеоплазму. Затем происходит отщепление транскриптазы от 5'-конца минус-цепи и достройка плюс-цепи ( рис. 2.31 , Б), которая может осуществляться как вирусной, так и клеточной транскриптазами. После этого возможно либо образование ковалентно замкнутой двухцепочечной ДНК (кздДНК), либо интегрирование линейной двухцепочечной ДНК в геном хозяйской клетки по случайному сайту ( рис. 2.31 , В). (Интегрированная ДНК гепаднавирусов встречается в гораздо меньших количествах (меньше 1 копий/кл.), чем кздДНК (более 500 копий/кл.).
Минус-цепь кздДНК является матрицей для синтеза субгеномных мРНК и прегеномной РНК (пгРНК) ( рис. 2.31 , Г, Д), которые все имеют одинаковый З'-конец, а их 5'-концы начинают синтезироваться с различных стартовых кодонов (прегеномная РНК, как и мРНК, полиаденилирована с З'-конца и 5'- кэпирована ).
Геном гепадновирусов содержит четыре промотора :
- preC/С для мРНК HBcAg и секретируемого HBeAg (последняя стартует с сайта, сдвинутого в сторону 5'-конца по сравнению с мРНК HBcAg ;
- preS1 - для L-HBsAg ;
- preS2/S - для M-HBsAg и S-HBsAg ;
- X для неструктурного белка X , который является активатором вирусной транскрипции.
Наиболее протяженной является пгРНК, которая включает открытые рамки считывания для HBcAg и полимеразы. HBcAg способен к самосборке в отсутствие других вирусных белков, но имеет на С-конце сайт связывания с РНК, поэтому в цитоплазме инфицированной клетки эффективно формируются и дефектные, лишенные генома, и правильные нуклеокапсиды. В последние вместе с пгРНК включается вирусная протеаза, Hsp70 и Hsp90 , которые образуют комплекс с так называемым эпсилон-фрагментом пгРНК ( рис. 2.31 , Е).
Обратная транскрипция пгРНК (прегеномной РНК) происходит внутри формирующихся нуклеокапсидов. Эпсилон-фрагмент пгРНК формирует шпильку с боковым расплетением, вдоль которого вирусная полимераза синтезирует короткий (несколько н.о.) ДНК-фрагмент, используя свойства своего TP- домена выступать в качестве затравки для синтеза комплементарной ДНК. (Полимераза гепаднавирусов - обратная транскриптаза - обладает тремя типами активности: РНК-зависимой ДНК-полимеразы, ДНК-зависимой ДНК- полимеразы и РНКазы Н ). Синтезированный ДНК-фрагмент с ковалентно присоединенным на 5'-конце TP-доменом полимеразы ( рис. 2.31 , Ж) служит затравкой для синтеза минус-цепи ДНК, для чего он связывается с комплементарным сайтом DR1 на З'-конце пгРНК ( рис. 2.31 , 3). Синтез плюс-цепи ДНК ( рис. 2.31 , И) сопровождается расщеплением матричной пгРНК ( рис. 2.31 , К) и продолжается до тех пор, пока эпсилон-фрагмент на З'-конце вновь синтезированной цепи не сформирует шпильку и не прервет синтез ( рис. 2.31 , Л). Оставшийся нерасщепленным фрагмент DR1 плюс-цепи пгРНК ( рис. 2.31 , Л) связывается с идентичным сайтом DR2 на 5'-конце минус-цепи вирионной ДНК ( рис. 2.31 , М) и инициирует синтез плюс-цепи ДНК ( рис. 2.31 , Н) в области нахлеста между 5'-концами плюс- и минус-цепи вирионной ДНК ( рис. 2.31 , А). Шпилька эпсилон-фрагмента на З'-конце минус-цепи ДНК образует комплекс с TP-доменом полимеразы и клеточными белками-шаперонами , замыкая минус-цепь ДНК в кольцо ( рис. 2.31 , О), вдоль которого и продолжается синтез комплементарной плюс-цепи ДНК ( рис. 2.31 , П), пока не обрывается по случайному сайту ( рис. 2.31 , Р).
Все три типа HBsAg ( L-HBsAg , M-HBsAg и S-HBsAg ) имеют общую группоспецифическую детерминанту, обозначаемую "а", с которой связана нейтрализующая способность антисывороток. Кроме того, для HBV имеются две пары антигенных детерминант (d или у) и (w или r), которые в подавляющем большинстве случаев ведут себя как аллели, исключая друг друга. Для w описано 4 варианта: w1,, w2, w3 и w4. Для вариантов вируса с необычными серологическими свойствами предложены дополнительные типы антигенных детерминант: q, х и g. В настоящее время описано 8 основных серотипов HBV: ayw1, ayw2, ayw3, ayw4, ayr, adw2, adw4, adr. Наличие вариантов вируса с мутациями антигенных детерминант, не нейтрализуемых антителами к обычному антигену, имеет существенное практическое значение при проведении вакцинопрофилактики. Несмотря на то что HBeAg отличается от HBcAg лишь небольшим (16 кДа) дополнительным фрагментом на N-конце (благодаря которому он способен секретироваться во внеклеточное пространство), у HBeAg имеется собственная уникальная антигенная детерминанта. Наличие специфических антител против HBcAg и HBeAg является маркером острой фазы HBV-инфекции , против HBsAg - контакта с HBV.
Смотрите также:
