Репликация и жизненный цикл ретровирусов
Стратегия репликации ретровирусов основана главным образом на заражении чувствительных клеток при контакте с инфекционными вирусными частицами и направлена на установление долгосрочной персистирующей инфекции, способной распространяться как вертикально (при делении клеток), так и горизонтально (от клетки к клетке).
Ретровирусы (за исключением лентивирусов ) не уничтожают инфицированные клетки. После проникновения в клетку РНК ретровирусов служит матрицей для синтеза линейной двухцепочечной комплементарной ДНК (кДНК) при участии фермента обратной транскриптазы (ревертазы) . На последующих этапах происходит интеграция полученной ДНК в хромосому клетки-хозяина.
Цикл развития ретровирусов ( рис. 192.1 ) состоит из двух этапов.
На первом этапе вирусы адсорбируются на специфических мембранных рецепторах клетки и проникают в цитоплазму, где при участии обратной транскриптазы на матрице вирусной РНК образуется двухцепочечная ДНК - провирус . Затем провирус переходит в ядро, встраивается в геном клетки-хозяина и сохраняется в таком состоянии в течение длительного времени. Хотя некоторые ретровирусы животных встраиваются только в один определенный участок генома во всех зараженных клетках, четыре ретровируса, патогенных для человека ( Т-лимфотропный вирус человека типа 1 , Т-лимфотропный вирус человека типа 2 , ВИЧ-1 и ВИЧ-2 ), встраиваются в клеточную ДНК случайным образом.
Первый этап репродукции полностью осуществляется вирусными белками и нуклеиновыми кислотами.
На втором этапе происходит синтез и процессинг вирусных геномов, мРНК и белков при участии структур клетки-хозяина, что тоже во многом контролируется продуктами вирусных генов. В дальнейшем происходит сборка вирусов и выход их из клетки путем отпочковывания; при этом белки клеточной мембраны нередко включаются в состав внешней оболочки вирусов.
Более последовательно жизненный цикл (т.е. период от заражения клетки-мишени до образования инфекционного вирусного потомства) ретровирусов можно разделить на следующие этапы ( рис. 2.14 ):
-> присоединение вируса к рецепторам клетки и последующее слияние мембран;
-> "раздевание" вируса; вирусная РНК освобождается от белков капсида и нуклеокапсида;
-> обратная транскрипция вирусной РНК с участием фермента обратной транскриптазы ; образуется двухцепочечная ДНК-копия вирусного генома;
-> миграция (транслокация) ДНК в ядро клетки; ДНК в составе преинтеграционного комплекса проникает через ядерную мембрану;
-> интеграция ДНК в хромосомную ДНК клетки с участием фермента интегразы; интегрированная ДНК получает название провирусной ДНК;
-> транскрипция провирусной ДНК с участием клеточного фермента РНК-полимеразы; регулируется взаимодействием вирусного LTR с клеточными факторами трансактивации;
-> сплайсинг РНК и транспорт сплайсированной и мРНК из ядра в цитоплазму; синтез вирусных белков с участием клеточных ферментов;
-> транспорт вирусных белков к месту сборки, упаковка и сборка новых вирионов ;
-> отпочковывание и созревание вирусных частиц с участием фермента протеазы.
Обратная транскрипция обеспечивается сочетанием нескольких активностей RT , включая собственно обратную транскрипцию (синтез минус- цепи ДНК на матрице РНК), разрушение РНК в составе образующегося гибрида РНК-ДНК (РНКазаН-активность), расплетание двухцепочечных спиралей ДНК (хеликазная активность) и ДНК-полимеразная активность. Включает несколько этапов ( рис. 2.15 ).
1. Синтез минус-цепи ДНК инициируется присоединением тРНК-праймера к 5'-концевому PBS вирусной РНК, имеющей структуру: 5'-R-U5-PBS-gag-pol-env-U3-R-3'. Синтезируется участок, комплементарный U5 и R, РНКазаН-RT разрушает R и U5 вирусной РНК; образовавшийся фрагмент ДНК носит название минус-цепи strong-stop ДНК, т.к. в этот момент происходит некоторая задержка синтеза.
2. Strong-stop ДНК вместе с RT совершает первый "прыжок" и комплементарно присоединяется к области R З'-конца вирусной РНК, где выступает в роли праймера; по мере элонгации минус-цепи ДНК образуется гибрид ДНК-РНК, РНКазаН-RT разрушает РНК в составе гибрида, за исключением РРТ , сохраняющим связь с ДНК.
3. Используя РРТ в качестве праймера, RT начинает синтез плюс-цепи ДНК; после разрушения РРТ (РНКазаН-RT) образуется плюс-цепь strong-stop ДНК, которая совершает второй "прыжок" и, закрепляясь на участке PBS минус-цепи ДНК, в свою очередь, служит праймером (на этом этапе тРНК утрачивается).
4. Применяя свою ДНК-полимеразную активность, RT достраивает обе цепи с образованием двухцепочечной провирусной ДНК, имеющей структуру с идентичными концами: 5'-U3-R-U5-PBS-gag-pol-env-U3-R-U5-3', соответствующими полной последовательности LTR.
В инфицированных клетках обнаруживают три вида провирусной ДНК: линейную форму и две кольцевые, содержащие два или один LTR. Образование кольцевых форм является результатом разных вариантов лигирования комплементарных друг другу LTR, но инфекционными являются только 2-LTR и линейная ДНК, причем максимально эффективно перемещается в ядро клетки и интегрируется в хромосому кольцевая молекула ДНК.
Гены провирусной ДНК ретровирусов в составе хромосомной ДНК находятся в том же порядке, в каком они расположены в геноме вируса. В результате интеграции происходит укорочение обоих концов вирусной ДНК на два нуклеотида (структура концов одинакова для всех ретровирусов 5'-TG ...СA-3'), при этом хромосомная ДНК претерпевает дупликацию на 4-6 нуклеотидов, в зависимости от групповой принадлежности ретровируса; при этом события развиваются следующим образом.
1. В составе рибонуклеопротеидного комплекса, включающего вирусные CA белок , IN белок , RT белок и NC белок , вирусная ДНК попадает в ядро клетки.
2. В результате проявления экзонуклеазной активности IN на 3m-концах вирусной ДНК удаляются по два нуклеотида att-сайта (возможно, этот процесс происходит ранее в цитоплазме); на каждом из 3m-концов формируются гидроксильные (ОН-) группы (3m-процессинг ДНК).
3. Вследствие проявления эндонуклеазной и других активностей IN в хромосомной ДНК создаются одноцепочечные 5m-концы с избытком 4-6 нуклеотидов.
4. Клеточные ферменты репарации ДНК достраивают пробел и, используя лигазную активность IN, ковалентно сшивают концы вирусной и хромосомной ДНК (реакция переноса цепи); на обоих флангах провируса образуются короткие повторы клеточной ДНК.
Хромосома и последовательность ДНК в участке встраивания не имеют существенного значения, в выборе участка интеграции ведущую роль играет, по-видимому, транскрипционная активность участка ДНК. Несколько геномов ретровируса могут быть интегрированы в одну клетку.
Провирусы встраиваются в клеточный геном во время периода S клеточного цикла, поэтому ретровирусы (кроме лентивирусов ) не способны заражать непролиферирующие клетки. Однажды возникнув, ретровирусная инфекция сохраняется пожизненно.
Смотрите также:
