Клетки мышиной миеломы (линия Sp2/0)
Клетки миеломы применяются для получения гибридом - линий клеток, производящих моноклональные антитела определенной специфичности. Поскольку эти клетки осуществляют эффективную секрецию рекомбинантных белков, они хорошо изучены в отношении экспрессии в них соответствующих рекомбинантных генов, введенных с помощью трансфекции .
Клетки способны расти в суспензионной культуре (без прикрепления к поверхности субстрата), что облегчает их культивирование при необходимости крупномасштабной наработки.
Линия клеток мышиной миеломы Sp2/0 Ag14 , утративших способность синтезировать или секретировать иммуноглобулины , используется для производства рекомбинантных белков. Клетки этой линии легко трансфецируемы рекомбинантными ДНК и могут выращиваться в больших количествах на питательной среде без дорогостоящей сыворотки. Клетки Sp2/0 экспрессируют эндогенный ген ДГФР , что делает невозможным их прямое применение для амплификации рекомбинантных ДНК с использованием метотрексата . Это затруднение преодолевают путем введения в экспрессирующий вектор мутантного гена ДГФР, в котором точковая мутация, сопровождаемая заменой T->G, приводит к замещению Leu->Arg в положении 22 полипептидной цепи ДГФР, следствием чего является понижение сродства фермента к метотрексату в 270 раз. Благодаря этому после трансфекции может быть проведен отбор клеток, содержащих мутантный ген ДГФР вместо нормального, путем постепенного увеличения концентрации метотрексата в среде. При умеренных концентрациях ингибитора эндогенный ген ДГФР полностью инактивируется, тогда как мутантный ген остается активным и может быть амплифицирован после повышения концентрации метотрексата в среде. Уровень амплификации гена ДГФР и ассоциированного с ним рекомбинантного гена в такой системе ниже, чем в обычной, так как меньшее число внутриклеточных копий мутантного гена требуется для обеспечения необходимого уровня устойчивости клеток к ингибитору. Кроме того, было показано, что высокий уровень внутриклеточной экспрессии рекомбинантных генов, введенных в клетки Sp2/0 с помощью трансфекции, может обеспечиваться после инкубации с метотрексатом за счет увеличения скорости их транскрипции, а не в результате их амплификации. Такой результат может быть получен в результате введения множественных копий гена ДГФР при трансфекции.
Структура одного из векторов, пригодного для использования с миеломными клетками Sp2/0, представлена на рис. II.13,б ). Транскрипция трансгенов в этом векторе обеспечивается промоторно- энхансерными элементами гена иммуноглобулина с участием эндогенных регуляторных факторов клеток миеломы.http://
Смотрите также:
